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암세포는 세포 스트레스를 극복하고 계속 진행하기 위해 다양한 메커니즘을 진화시켜 왔습니다.Protein kinase R(PKR)과 protein activator(PACT)는 다양한 스트레스 신호를 모니터링하여 세포 증식과 세포자멸사를 억제하는 초기 반응자입니다.그러나 암 세포에서 PACT-PKR 경로의 조절은 크게 알려지지 않았습니다.여기에서 우리는 긴 비암호화 RNA(lncRNA) 아스파르틸 tRNA 합성효소 안티센스 RNA 1(DARS-AS1)이 PACT-PKR 경로의 억제에 직접 관여하고 암세포 증식을 촉진한다는 것을 발견했습니다.CRISPRi 971 암 관련 lncRNA의 대규모 기능 스크리닝을 사용하여 우리는 DARS-AS1이 유의하게 향상된 암세포 증식과 관련이 있음을 발견했습니다.따라서, DARS-AS1 녹아웃은 시험관 내에서 다양한 암 세포주에서 세포 증식을 억제하고 암세포 사멸을 촉진하고 생체 내에서 종양 성장을 유의하게 감소시킨다.기계적으로 DARS-AS1은 PACT 활성화 도메인에 직접 결합하고 PACT-PKR 상호작용을 방지하여 PKR 활성화, eIF2α 인산화를 감소시키고 세포 사멸을 억제합니다.임상적으로 DARS-AS1은 여러 암에서 널리 발현되며, 이 lncRNA의 과발현은 불량한 예후를 나타냅니다.이 연구는 DARS-AS1 lncRNA에 의한 PACT-PKR 경로의 암 특이적 조절을 설명하고 암 예후 및 치료를 위한 또 다른 표적을 제공합니다.
스트레스에 적응하는 능력은 암세포의 생존과 증식의 중요한 특징입니다.암의 급속한 증식 및 대사 특징은 세포 사멸 신호 경로를 유발할 수 있는 가혹한 미세 환경(영양소 결핍, 저산소증 및 낮은 pH)에서 최고조에 달합니다.p535, 열 충격 단백질 6, 7, KRAS8, 9, HIF-110, 11, 12, 13과 같은 스트레스 민감 유전자의 조절 장애는 암에서 자주 관찰되어 세포 사멸을 차단하고 생존을 촉진합니다.
단백질 키나제 R(PKR)은 중요한 스트레스 센서이자 진핵생물 개시 인자 2α(eIF2α)의 소단위 키나제이며, 세포 스트레스와 세포 사멸을 연결하는 번역 조절인자입니다.PKR은 원래 외래 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 검출에 의해 항바이러스 단백질로 확인되었습니다.활성화되면 PKR은 eIF2α를 인산화하여 바이러스 및 세포 단백질 합성을 억제합니다14,15,16.PACT(PKR 활성화제 단백질)는 dsRNA17,18,19,20,21,22,23이 없는 경우 최초의 PKR 활성화제 단백질로 확인되었습니다.PKR과의 직접적인 상호작용을 통해 PACT는 다양한 스트레스(혈청 기아, 과산화물 또는 아비산염 처리)를 PKR 및 다운스트림 신호 전달 경로로 전달합니다.eIF2α 인산화 외에도 PACT 매개 PKR 활성화는 PI3K/Akt24 경로를 통한 변경된 산화환원 상태, p5325,26 및 NF-κB27,28을 통한 향상된 DNA 손상 검사를 포함하여 스트레스 반응과 관련된 다양한 이벤트를 유발합니다. 스트레스 반응, 증식, 세포자멸사 및 기타 주요 세포 과정에서 중요한 역할을 감안할 때 PKR과 PACT는 많은 질병, 특히 암에 대한 유망한 치료 표적입니다30,31,32,33.그러나 이러한 다면발현 기능 및 생물학적 중요성에도 불구하고 암세포에서 PACT/PKR 활성의 조절은 여전히 ​​애매합니다.
lncRNA는 단백질 코딩 가능성이 없는 200개 뉴클레오티드보다 큰 전사체입니다.최첨단 전체 게놈 시퀀싱 프로젝트가 수천 개의 lncRNA를 식별한 이후로,35,36 그들의 생물학적 기능을 밝히기 위해 많은 노력을 기울였습니다.점점 더 많은 연구에 따르면 lncRNA는 X-염색체 비활성화38,39, 각인40, 전사41,42, 번역43, 심지어 암 성장44,45,46,47의 조절을 비롯한 많은 생물학적 과정37에 관여합니다.이러한 연구는 많은 lncRNA가 PACT/PKR 경로에 관여한다고 보고했습니다.그러한 연구 중 하나는 lncRNA ASPACT가 PACT 전사를 억제하고 PACT mRNA의 핵 보유를 증가시키는 것으로 나타났습니다.다른 연구에서는 lncRNA nc886이 PKR에 결합하고 인산화를 억제한다는 것이 밝혀졌습니다49,50.지금까지 PACT 매개 PKR 활성화를 조절하는 lncRNA는 보고되지 않았습니다.
Aspartyl-tRNA 합성 효소 안티센스 RNA 1(DARS-AS1)은 발암성 lncRNA51,52,53,54로 확인되었습니다.miP-194-5p53, miP-12952 및 miP-532-3p51의 조절을 통해 DARS-AS1은 각각 투명 세포 신세포 암종, 갑상선 암종 및 비소세포 폐암종의 성장을 촉진하는 것으로 나타났습니다.Tong과 동료들은 또한 DARS-AS1이 단백질 39(RBM39) RNA 결합 모티프의 안정성을 유지함으로써 골수종 진행을 촉진한다는 것을 발견했습니다.그러나 이 lncRNA가 PACT-PKR 활성화 조절 및 암세포의 스트레스 반응에 관여하는지에 대한 연구는 수행되지 않았다.
여기에서 우리는 CRISPRi 시스템을 사용하여 대규모 기능 상실 스크린을 수행하고 DARS-AS1 lncRNA가 여러 유형의 암세포의 증식을 촉진한다는 것을 확인했습니다.또한 DARS-AS1이 PACT에 직접 결합하고, PACT 및 PKR 결합을 억제하고, 낮은 PKR 기질인 eIF2α의 인산화를 방지하고, 궁극적으로 세포 사멸을 억제하는 주요 메커니즘을 확인했습니다.결론적으로, 우리의 연구는 DARS-AS1 lncRNA가 PACT-PKR 경로의 조절자이자 암 치료 및 예후의 잠재적 표적임을 밝혀냅니다.
광범위한 게놈 프로파일링 연구에서 암과 관련된 수백 개의 lncRNA가 확인되었습니다.그러나 그들의 기능은 크게 알려지지 않았습니다56.암 진행과 관련된 유망한 lncRNA 후보를 확인하기 위해 CRISPRi 시스템을 사용하여 SW620 결장직장암 세포주에서 증식 감소에 대한 기능 상실 스크리닝을 수행했습니다(그림 1a).SW480 및 SW620 결장암 세포주의 독특한 특징은 단일 환자의 1차 및 2차 종양에서 유래한다는 것입니다.이것은 진행성 결장암의 진행에서 유전적 변화를 연구하는 데 귀중한 비교를 제공합니다.따라서 우리는 RNA 시퀀싱을 사용하여 대장암 세포주(SW480 및 SW620)의 전사체를 분석하고 출판된 문헌에서 잠재적인 기능적 lncRNA를 수집했습니다.이러한 결과를 기반으로 우리는 음성 대조군을 위해 971개의 암 관련 lncRNA와 500개의 표적화되지 않은 sgRNA 올리고를 표적으로 하는 7355개의 sgRNA 올리고를 포함하는 풀링된 sgRNA 라이브러리를 설계했습니다(보충 데이터 1).
CRISPRi 시스템을 사용한 스크리닝의 도식적 표현.b 스크리닝 후 sgRNA 농축.수평 점선은 log2(배수 변화) = ±0.58을 나타냅니다.수직 점선은 p 값 = 0.05를 나타냅니다.검은 점은 비표적 sgRNA(NC로 지정)를 나타냅니다.빨간 점은 DARS-AS1을 표적으로 하는 sgRNA입니다.파란색 점은 이전에 설명된 발암성 lncRNA인 LINC00205를 표적으로 하는 sgRNA입니다.배수 변화 = (정규화 판독, 17일)/(정규화 판독, 0일).c DARS-AS1 sgRNA 녹다운은 세포 성장을 억제했습니다.오차 막대는 세 가지 실험의 ± 표준 편차를 나타냅니다.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 양측 스튜던트 t-검정.d 종양에서의 DARS-AS1 발현(TCGA 데이터세트).em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP 및 COAD 환자의 정상 및 종양 샘플 쌍에서 각각 DARS-AS1의 발현(TCGA 데이터 세트).p-값은 쌍을 이루는 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 얻었습니다.
플라스미드를 구성하고 렌티바이러스를 패키징한 후, 우리는 4개의 독립적인 감염 실험에서 위의 라이브러리로 dCas9-SW620 대장암 세포주를 형질도입했습니다.이러한 감염에 대한 감염 다중도(MOI)는 0.1–0.3으로, 각 세포가 하나의 sgRNA로만 형질감염될 수 있음을 나타냅니다.시험관 내 배양 18일 후, 표적 sgRNA의 농축 프로파일은 스크리닝 후 감소하거나 증가하는 반면, 비표적 대조군 올리고뉴클레오티드의 수는 사전 스크리닝 프로파일과 비교하여 상대적으로 변하지 않은 채로 남아 있어 표적이 고도로 스크린 특이적임을 나타냅니다. 도서관.쌀.1b 및 보충 표 1). 이전에 폐암 및 간암 진행을 촉진하는 것으로 보고된 LINC0020558,59,60이 스크리닝되어(log2(foldchange) < -0.58, p 값 < 0.05), 이 스크리닝의 신뢰성을 확인했습니다(그림 1b). 이전에 폐암 및 간암 진행을 촉진하는 것으로 보고된 LINC0020558,59,60이 스크리닝되어(log2(foldchange) < -0.58, p 값 < 0.05), 이 스크리닝의 신뢰성을 확인했습니다(그림 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). 이전에 폐암 및 간암의 진행을 촉진하는 것으로 보고된 LINC0020558,59,60은 제외되었으며(log2(배수 변화) <-0.58, p-값 <0.05), 이 스크리닝의 견고성을 확인했습니다(그림 .1b). . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）성 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）성 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). 이전에 폐암 및 간암 진행58,59,60을 촉진하는 것으로 보고된 LINC00205는 제외되어(log2(배수 변화) <-0.58, p-값 <0.05), 이 스크리닝의 견고성을 확인했습니다(그림 .1b).
테스트한 모든 lncRNA 중에서 DARS-AS1도 스크리닝되었으며, 배양 18일 후에 3개의 동족 sgRNA 올리고뉴클레오티드가 크게 감소하여 이 lncRNA의 녹다운이 암 증식을 감소시켰음을 시사합니다(그림 1b).이 결과는 DARS-AS1 녹다운 세포의 성장률이 대조군 세포(그림 1c)에 비해 겨우 절반으로 줄어들었고 여러 다른 암 유형에 대한 이전 보고서와 일치함을 보여주는 결장직장암 세포의 MTS 분석에 의해 추가로 뒷받침되었습니다.: 투명세포신장암, 갑상선암, 비소세포폐암51,52,53,55.그러나 결장직장암에서 그 기능과 분자적 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다.따라서 우리는 추가 연구를 위해 이 lncRNA를 선택했습니다.
환자에서 DARS-AS1 발현을 연구하기 위해 TCGA(Cancer Genome Atlas) 프로젝트에서 10,327개의 종양 샘플을 종합적으로 분석했습니다.우리의 결과는 DARS-AS1이 결장 선암종(COAD), 신장 투명 세포 암종(KIRC) 및 신장 유두 세포 암종(KIRP)을 포함한 다양한 종양의 건강한 세포에서 널리 발현되고 유의하게 상향 조절된다는 것을 보여줍니다..매우 적습니다(그림 1d 및 보충 그림 1a, b). 쌍을 이루는 건강한/종양 샘플의 분석은 방광 요로상피암(BLCA), 신장 투명 세포 암종(KIRC), 전립선 선암(PRAD), 폐 편평 세포 암(LUSC)의 종양에서 DARS-AS1의 유의하게 더 높은 발현을 추가로 확인했습니다. , 자궁 내막 암종(UCEC), 폐 선암종(LUAD), 간 간세포 암종(LIHC), 신장 신장 유두 세포 암종(KIRP) 및 결장 선암종(COAD)(p 값 < 0.05)(그림 1e–m) . 쌍을 이루는 건강한/종양 샘플의 분석은 방광 요로상피암(BLCA), 신장 투명 세포 암종(KIRC), 전립선 선암(PRAD), 폐 편평 세포 암(LUSC)의 종양에서 DARS-AS1의 유의하게 더 높은 발현을 추가로 확인했습니다. , 자궁 내막 암종(UCEC), 폐 선암종(LUAD), 간 간세포 암종(LIHC), 신장 신장 유두 세포 암종(KIRP) 및 결장 선암종(COAD)(p 값 < 0.05)(그림 1e–m) .한 쌍의 건강한/종양 샘플의 분석은 또한 방광 요로상피암(BLCA), 투명 세포 신장 및 신장 세포 암(KIRC), 전립선 선암(PRAD), 폐 편평 세포 암(LUSC) 종양에서 DARS-AS1의 상당히 더 높은 발현을 확인했습니다., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– 중) . , 자궁내막암종(UCEC), 폐선암종(LUAD), 간세포암종(LIHC), 신장 유두세포암종(KIRP), 결장선암종(COAD)(p값 < 0.05) (그림 1e-m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA), 肾肾透明细胞癌(KIRC),显着更高表达，子宫体子宫内膜癌(UCEC)，肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC） <0.05)(图1e-m) .配 配 健康 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 证实 了 了 Dars-os1 在 尿路 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高表达 ， 内膜 癌 （ucel） 肺腺癌 （luad） 肿 膜 癌 （ucel）癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .건강한/종양 쌍을 이루는 샘플의 분석은 방광 요로상피암(BLCA), 투명 세포 신세포 암(KIRC), 전립선 선암(PRAD) 및 폐 편평 세포 암(LUSC) 종양에서 DARS-AS1의 역할을 추가로 뒷받침했습니다.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -중). 코퍼스 자궁 암종(UCEC), 폐 선암종(LUAD), 간세포 암종(LIHC), 신장 유두 세포 암종(KIRP) 및 결장 선암종(COAD)에서의 발현(p 값 <0.05)(그림 1e-m).종합하면, 이러한 결과는 DARS-AS1이 다양한 암에서 광범위하고 고도로 발현된다는 것을 나타냅니다.
DARS-AS1과 DARS(안티센스 가닥을 인코딩하는 유전자)는 동일한 프로모터를 공유하고 서로 옆에 있기 때문에 DARS가 아닌 DARS-AS1을 특이적으로 녹다운하도록 shRNA를 설계했습니다(보충 그림 2a, b 및 보충 표 2). .SW620 외에도 DARS-AS1을 고도로 발현하는 3개의 다른 세포주를 사용하여 shRNA 녹다운의 효능과 기능을 연구했습니다(보충 표 3).우리의 결과는 개발된 3개의 shRNA가 모두 DARS mRNA의 양에 거의 영향을 미치지 않으면서 최소 80%의 DARS-AS1 녹다운 효율을 달성했음을 나타냅니다(보충 그림 2c-f).또한, 우리는 이러한 shRNA를 사용한 DARS-AS1 녹다운이 결장직장암 세포주 SW620(49.7%) 및 HCT116(27.7%), 유방암 세포주 MBA-MD-231(53.4%)에서 세포 성장을 유의하게 억제한다는 것을 발견했습니다.) 및 HepG2 간암 세포주(92.7% 감소), 고정되지 않은 구체를 형성하는 능력(세포주당 평균 ~50.8%, 44.6%, 40.7% 및 75.7% 감소)(그림 2a, b).SW620에서 콜로니 형성 분석 결과 DARS-AS1 shRNA가 평균 약 69.6%의 감소로 세포 증식을 유의하게 억제함을 추가로 확인했다(그림 2c).
SW620, HCT116, MBA-MD-231 및 HepG2 세포에서 대조군 shRNA 및 DARS-AS1 shRNA가 세포 증식(a) 및 스페로이드 형성(b)에 미치는 영향.c SW620 세포에서 콜로니 형성에 대한 대조군 shRNA 및 DARS-AS1 shRNA의 효과.DARS-AS1을 과발현하는 SW620 세포의 세포 증식(d), 스페로이드 형성(e) 및 콜로니 형성(f).표시된 데이터는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차입니다.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 및 *** p ≤ 0.001 양측 스튜던트 t-검정.
기능 상실 연구를 보완하기 위해 다음으로 DARS-AS1을 과발현하는 SW620 세포를 만들었습니다(보충 그림 2g).DARS-AS1 과발현은 SW620 세포에서 세포 성장(1.8배), 고정되지 않은 회전 타원체 형성(1.4배) 및 콜로니 형성(3.3배)을 유의하게 증가시켰습니다(그림 2d-f).우리는 다른 DARS-AS1 발현 세포주인 A549를 사용하여 이 결과를 확인했습니다.DARS-AS1 과발현으로 인한 이러한 향상된 세포 증식은 A549 세포에서 추가로 관찰되었습니다(보충 그림 2h, i 및 보충 표 3).종합하면, 이러한 이득 및 손실 연구는 DARS-AS1이 시험관 내에서 암세포 증식을 촉진한다는 것을 보여줍니다.
DARS-AS1이 세포 증식을 조절하는 기본 메커니즘을 탐구하기 위해 우리는 RNA 풀다운 분석을 수행하여 잠재적인 단백질 결합 파트너를 식별했습니다.RT-qPCR 결과 DARS-AS1의 약 86.2%가 SW620 세포의 세포질에 위치하는 것으로 나타났습니다(보충 그림 3a).그런 다음 시험관 내에서 전사된 비오틴화된 DARS-AS1 또는 pseudoRNA를 SW620 세포 용해물과 함께 인큐베이션한 다음 SDS-PAGE 분리를 수행했습니다.후속 은 염색은 DARS-AS1 풀 샘플에서 뚜렷한 밴드(~38 kDa)가 상당히 풍부했지만 더미 RNA 또는 비드 샘플에서는 그렇지 않은 것으로 나타났습니다(그림 3a).이 밴드는 질량 분석법(MS)에 의해 PKR 활성화 단백질(PACT)로 확인되었으며 SW620, HCT116 및 HepG2 세포주에서 면역 블로팅에 의해 추가로 확인되었습니다(그림 3a, b).DARS 및 관련 PACT 단백질(PKR 및 TRBP)의 농축도 Western blotting(WB)에 의한 RNA 분석을 사용하여 조사되었습니다.결과는 DARS-AS1 RNA와 이 세 가지 단백질 사이에 직접적인 상호 작용이 발견되지 않았음을 나타냅니다(보충 그림 3b).DARS-AS1과 PACT 사이의 특이적 상호작용은 RNA 면역침전(RIP) 분석에 의해 추가로 확인되었는데, 이는 DARS-AS1이 항-PACT 항체가 유의하게 풍부하지만 다른 대조군 RNA는 풍부하지 않다는 것을 보여주었습니다(그림 3c).DARS-AS1이 다른 세포 구성 요소 없이 PACT와 직접 상호 작용하는지 확인하기 위해 정제된 PACT를 사용하여 시험관 내 생물층 간섭계(BLI) 분석을 수행했습니다.비오틴으로 표지된 DARS-AS1 또는 더미 RNA를 스트렙타비딘(SA) 바이오센서에 고정화한 다음 1μM PACT를 포함하는 운동 완충액에서 인큐베이션했습니다.특히, PACT는 DARS-AS1(KD 값 ~26.9nM)에 강하게 결합했지만 RNA를 모방하지는 않았습니다(그림 3d).종합하면, 이러한 결과는 DARS-AS1과 PACT 사이의 직접적인 상호작용 및 높은 친화도를 보여줍니다.
RNA 풀 분석은 SW620 세포에서 PACT와 상호작용하는 DARS-AS1을 확인했습니다.위, 관련 단백질의 은염색.더 낮은 면역블롯은 항-PACT 항체로 수행되었습니다.b RNA 풀다운 분석은 HCT116(상단) 및 HepG2(하단) 세포에서 수행되었습니다.PACT 농축은 면역블롯팅에 의해 검출되었습니다.표시된 항체를 사용하여 SW620 세포에서 cRNA 면역침전(RIP) 분석을 수행했습니다.d 전장 DARS-AS1 또는 대조군 RNA에 대한 PACT 결합 곡선은 생물층 간섭계(BLI)를 사용하여 얻었다.RNA는 streptavidin 바이오센서에 고정되었습니다.1μM PACT를 사용하여 연관성을 측정했습니다.e RNA 풀 분석은 비오틴화된 전장 DARS-AS1 또는 절단된(상단)을 사용하여 수행되었습니다.수신된 PACT를 보여주는 면역블롯(하단).f 정제된 플래그가 지정된 PACT를 비오티닐화된 전장 DARS-AS1과 함께 인큐베이션하거나 시험관내 RIP 분석을 위해 절단(e에서와 같이)했습니다.추출된 RNA는 RT-qPCR에 의해 확인되었습니다.g PACT에 대한 서로 다른 RNA 단편의 상대 친화도는 생물층 간섭계를 사용하여 얻었습니다.분석을 위해 100nM RNA와 1μM RAST를 사용했습니다.h 정제된 손상되지 않거나 잘린 표지된 PACT를 사용하여 시험관 내 RIP 분석을 수행했습니다.추출된 RNA는 RT-qPCR에 의해 확인되었습니다.i DARS-AS1, PACT 또는 둘 다를 과발현하는 SW620 세포의 성장률.j SW620 세포에서 전장 또는 절단된 DARS-AS1의 과발현은 세포 성장에 다른 영향을 미쳤습니다.k 항 PARP 항체를 이용한 면역블롯팅으로 세포자멸사를 검출하였다.l DARS-AS1의 녹아웃은 유세포 분석에 의해 나타난 바와 같이 SW620 세포의 세포자멸사를 유도합니다.표시된 데이터는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차입니다. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 양측 스튜던트 t 검정에 의해. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 양측 스튜던트 t 검정에 의해. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 양측 스튜던트 t-검정. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 양측 스튜던트 t-검정.
그런 다음 PACT 결합에 필요한 DARS-AS1 영역을 식별하기 위해 시험관 내 전사를 통해 3개의 비오틴화된 DARS-AS1 RNA 단편을 생성했습니다(그림 3e).RNA 분석 결과 각 단편은 PACT와 상호 작용할 수 있었지만 3'-말단 영역(A3로 표시된 384-768개 뉴클레오티드)은 A1으로 표시된 1-384개 이상의 뉴클레오티드를 보여주었습니다(그림 3e).재조합 PACT를 사용한 시험관내 RIP 분석에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(그림 3f).이러한 결과와 일치하게 BLI를 사용하여 고정된 RNA 단편을 PACT에 결합하는 실험은 PACT가 A3(384–768 nt)(약 94.6 nM의 KD 값)에 대해 더 높은 친화도를 갖는 반면 다른 영역과의 연결은 거의 없음을 보여주었습니다.(그림 3d).
우리는 또한 PACT에서 연관된 결합 영역을 조사했습니다.PACT는 3개의 기능적 도메인을 포함하며, 그 중 2개는 보존된 이중 가닥 RNA-결합 도메인(dsRBD)이고 다른 하나는 단백질 상호작용의 활성제로 작용하는 세 번째 도메인(D3으로 지정됨)입니다.각 도메인의 lncRNA 결합 능력을 조사하기 위해 3개의 도메인을 각각 제거하고 시험관 내 RIP 분석을 수행하는 3개의 돌연변이를 조작했습니다.우리의 결과는 PACT의 세 번째 도메인(D3)의 삭제가 다른 두 돌연변이(그림 3h)에 비해 DARS-AS1과의 상호작용을 유의하게 감소시켰음을 보여주었습니다(무손상 PACT와 비교하여 0.11배). D3의 DARS와 상호 작용했습니다.-AC1.종합하면, 이러한 결과는 DARS-AS1과 PACT 사이의 상호작용이 주로 DARS-AS1의 3' 말단과 PACT의 D3 도메인을 통해 발생할 수 있음을 시사한다.
우리는 DARS-AS1이 PACT 발현에 영향을 미치지 않았고 PACT가 DARS-AS1에 영향을 미치지 않았다는 점에 주목했습니다(보충 그림 3c).그런 다음 PACT 녹다운이 세포 성장에 미치는 영향을 조사했습니다.DARS-AS1과 달리 상대 세포는 PACT가 녹다운되었을 때 1.5-3배 더 빠르게 성장했습니다(보충 그림 3d).콜로니 형성 분석 결과는 PACT로 shRNA 처리 후 세포가 2-3배 콜로니를 형성함을 나타냅니다(보충 그림 3e).DARS-AS1이 PACT를 통해 세포 증식을 조절하는지 여부를 테스트하기 위해 우리는 PACT, DARS-AS1 또는 둘 다를 과발현하는 SW620 세포를 생성했습니다.PACT의 과발현은 세포 증식의 상당한 억제를 보여주었습니다(그림 3i).DARS-AS1 과발현 자체가 세포 증식을 유의하게 촉진한 반면, DARS-AS1 및 PACT를 과발현하는 세포의 성장률에는 유의한 차이가 없었다.이러한 결과는 PACT가 DARS-AS1 과발현으로 인한 증가된 증식을 상쇄할 수 있음을 시사합니다.
DARS-AS1의 서로 다른 영역은 서로 다른 PACT 결합 능력을 갖기 때문에 우리는 DARS-AS1 단편의 서로 다른 과발현에 의해 세포 증식에 ​​대한 상대적 영향을 조사했습니다.다른 두 단편과 비교하여 DARS-AS1은 DARS-AS1의 주요 PACT 관련 영역인 3' 말단(384-768 nt)에서 과발현되었으며, 이는 세포 증식을 자극하는 능력이 가장 높았습니다(그림 3j).이러한 결과는 DARS-AS1의 결합 능력과 생물학적 기능 사이에 양의 상관 관계가 있음을 나타냅니다.
PACT는 pro-apoptotic protein19로 보고되었습니다.따라서 우리는 DARS-AS1이 세포 사멸에 미치는 영향을 조사했습니다.예상대로 DARS-AS1 녹다운은 SW620 세포에서 PARP 절단을 유의하게 증가시켰고 SW620, HCT116, HepG2 및 MBA-MD-231 세포주에서 아넥신 V 양성 세포의 비율을 증가시켰습니다(그림 3k).삼).3f-h), 암세포에서 DARS-AS1의 항 세포자멸 효과가 PACT의 세포자멸 유도 기능과 반대임을 나타냅니다.종합하면, 이러한 결과는 DARS-AS1 발암성 기능의 기전이 PACT 기능의 억제를 통한 것일 수 있음을 시사한다.
다음으로, 우리는 DARS-AS1-PACT 연관의 기능적 의미를 탐구했습니다.PACT는 직접 상호작용을 통해 PKR을 활성화하는 것으로 보고되었으며, 이는 후속적으로 eIF2α 인산화를 향상시켜 번역 결실 및 세포자멸사를 유발합니다17.먼저, 우리는 DARS-AS1이 PACT 및 PKR의 세포 국소화에 영향을 미치는지 여부를 조사했습니다.공초점 형광 현미경 검사에서 PACT와 PKR은 평균 Pearson 상관 계수가 0.72인 SW620 세포에서 고도로 공국화되어 있음을 보여주었습니다.한편, DARS-AS1 과발현은 PACT 및 PKR 공동 국소화를 유의하게 감소시켰습니다(평균 피어슨 상관 계수 0.61)(그림 4a).DARS-AS1이 PACT-PKR 상호작용을 조절할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 우리는 SW620 세포 용해물에서 항-PACT 항체를 사용한 공동 면역침전(co-IP) 분석을 수행했습니다.PKR은 대조군 세포에서 항-PACT가 매우 풍부했던 반면, PKR 회수는 DARS-AS1을 과발현하는 세포의 용해물에서 유의하게 감소했습니다(그림 4b).정제된 표지된 PACT 및 PKR을 시험관내 단백질 결합 분석에 사용하였다.따라서 DARS-AS1을 제공했지만 대조군 RNA는 제공하지 않은 것들은 억제된 PACT-PKR 상호작용을 나타냈다(그림 4c).모든 결과는 DARS-AS1이 PACT 및 PKR 통신을 방해한 것으로 나타났습니다.
a 대조군 세포 또는 DARS-AS1을 과발현하는 세포에서 PACT와 PKR의 공동 국소화는 공초점 형광 현미경을 사용하여 관찰되었습니다.핵은 DAPI로 염색되었습니다.16장의 사진에서 통계적 결과를 얻었다.b 대조군 SW620 세포 또는 DARS-AS1을 과발현하는 세포의 세포 용해물에서 항-PACT 항체를 사용한 공동 면역침전(co-IP).c 표지된 PACT, 정제된 PKR 및 DARS-AS1 또는 모의 RNA를 사용하여 시험관 내에서 전사된 것을 시험관 내 단백질 결합 분석을 위해 인큐베이션했습니다.항-플래그 항체를 면역침전을 위해 사용하였다.d 표시된 항체를 사용한 면역블롯은 대조군 shRNA 또는 DARS-AS1-shRNA로 형질감염된 SW620 및 HCT116 세포에서 수행한 후 혈청 기아 상태로 수행했습니다.e DARS-AS1 발현 수준은 탑시가르긴에 대한 세포 감수성을 변경했습니다.SW620 세포를 DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 과발현 플라스미드 또는 대조군 플라스미드로 형질감염시켰다.세포를 48시간 동안 탑시가르긴으로 처리하고 MTS 시약을 사용하여 세포 생존율을 결정하였다.f 시험관내 전사된 DARS-AS1 또는 더미 RNA 및 정제된 PACT를 시험관내 활성화 분석 및 면역블롯 검출에 사용했습니다.g 이러한 항체를 사용한 면역블롯은 SW620-ctrl 세포(왼쪽) 또는 PKR 돌연변이를 과발현하는 세포(오른쪽)에서 수행되었습니다.그런 다음 이러한 세포를 대조군 shRNA 또는 DARS-AS1-shRNA로 형질감염시킨 후 혈청 기아 상태로 하였다.h 유세포 분석은 돌연변이 PKR의 비활성화가 SW620 세포에서 DARS-AS1에 의해 유도된 세포자멸사를 보상함을 보여주었습니다.i 표시된 항체를 사용한 면역블롯은 SW620(왼쪽) 또는 HCT116(오른쪽) 세포에서 수행되었습니다.대조군 shRNA 또는 DARS-AS1 shRNA로 형질감염된 세포는 혈청이 결핍되고 100nM PKR C16 억제제 또는 DMSO로 보충됩니다.스케일 바 = 5 μm.표시된 데이터는 세 가지 실험의 평균 ± 표준 편차입니다.* p ≤ 0.05 양측 스튜던트 t-검정.
일반적으로 PACT가 PKR17과 상호작용하면 Thr451에서 PKR 인산화가 유도될 수 있다고 믿어집니다.우리의 결과는 혈청 기아 후 DARS-AS1 녹다운 세포에서 PKR 인산화 수준이 유의하게 증가했음을 나타냅니다 (그림 4d 및 보충 그림 4a).따라서 우리는 주요 PKR 기질인 eIF2α의 인산화가 DARS-AS1 shRNA에 의해서도 유의하게 증가한다는 것을 발견했습니다(그림 4d 및 보충 그림 4a).Thapsigargin은 ER이 Ca2+를 방출하게 하는 ER 스트레스 요인입니다.탑시가르긴을 사용한 치료는 PACT의 발현과 활성화를 유도하는 것으로 보고되었으며, 이는 PKR과 더 상호작용하고 활성화하여 eIF2α 인산화를 증가시켜 세포자멸사를 유도합니다18,61.여기에서 우리는 DARS-AS1이 PACT/PKR 경로를 억제함으로써 세포가 스트레스를 극복하도록 도울 수 있는지 여부를 조사하기 위해 PACT/PKR 경로의 자극제로 탑시가르긴을 사용했습니다.우리는 DARS-AS1 발현 수준이 탑시가르긴에 대한 세포 내성과 양의 상관관계가 있음을 관찰했습니다.DARS-AS1을 과발현하는 SW620 세포는 탑시가르긴으로 처리했을 때 더 잘 생존한 반면, DARS-AS1 녹다운이 있는 세포는 더 민감해졌습니다(그림 4e).이러한 결과와 일치하게, DARS-AS1 과발현은 탑시가르긴 유도 PKR 인산화를 감소시켰다(보충 그림 4b).대조적으로, 탑시가르긴 처리 후, PKR과 eIF2α는 대조군 세포에 비해 DARS-AS1 녹다운 세포에서 더 높은 정도로 인산화되었다(보충 그림 4b).흥미롭게도 thapsigargin은 용량 의존적으로 DARS-AS1 발현을 유도했으며, 이는 DARS-AS1의 항스트레스 기능을 나타낼 수 있습니다(보충 그림 4c).또한 이러한 관찰을 확인하기 위해 시험관 내 활성화 분석을 수행했습니다.간단히 말해서, PKR은 항-PKR 항체를 사용하여 세포 용해물로부터 정제된 다음, 시험관 내에서 전사된 재조합 PACT 및 DARS-AS1과 함께 인큐베이션되었습니다.효소 반응 후 WB를 이용하여 phospho-PKR을 검출하였다.우리의 결과는 PKR 인산화가 DARS-AS1에 의해 유의하게 억제되었지만 대조군 RNA에 의해 억제되지 않았음을 나타냅니다(그림 4f).이러한 시험관내 및 생체내 결과는 DARS-AS1이 PACT 매개 PKR 활성화를 억제함을 시사한다.동시에 DARS-AS1이 있을 때 PACT 회복의 감소도 관찰했습니다(그림 4f).이 결과는 시험관 내 단백질 결합 분석의 결과(그림 4c)와 일치하며 PACT-PKR 결합에 대한 DARS-AS1의 차단 기능을 다시 보여줍니다.
PACT의 D3 도메인에 있는 Ser246 및 Ser287은 세포 스트레스 하에서 PKR 활성화에 필요합니다.알라닌에 대한 2개의 세린 잔기의 치환은 돌연변이 PACT(mutD)를 제공하여 스트레스가 없을 때 PKR을 활성화하고 알라닌(mutA)에 대한 치환은 프로토콜을 역전시켰다.우리는 DARS-AS1과 직접적으로 관련하여 이 도메인의 중요성을 입증했기 때문에 이러한 잔기가 DARS-AS1과의 상호작용에도 관여할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 이 두 PACT 돌연변이를 생성했습니다.흥미롭게도 두 돌연변이 모두 DARS-AS1에 결합하는 능력을 상실했으며(보충 그림 4d), 이는 DARS-AS1과의 효율적인 상호 작용을 위해 PACT 단백질의 완전한 구조가 필요할 수 있음을 시사합니다.
또한, 우리의 결과는 DARS-AS1-shRNA 유도 세포 증식 억제가 우성 음성 PACT 돌연변이체(PACTmutA) 또는 우성 음성 PKR 돌연변이체(PKRmut)를 과발현함으로써 부분적으로 회복될 수 있음을 시사합니다(보충 그림 4e. e).우성-음성 PKR 돌연변이의 과발현은 DARS-AS1 녹다운에 의해 유도된 PKR 인산화와 혈청 결핍 세포에서 eIF2α 인산화를 감소시켰다(그림 4g).더 중요한 것은 DARS-AS1 녹다운에 의해 유도된 세포 사멸 세포의 비율도 PKRmut을 과발현하는 세포에서 감소했다는 것입니다(그림 4h 및 보충 그림 4g).PKR 키나아제 활성의 억제는 또한 DARS-AS1 기능을 손상시킵니다. 결과에 따르면 DARS-AS1 녹다운은 세포가 PKR 특이적 C16 억제제로 처리될 때 PKR 및 eIF2α 인산화를 거의 유발하지 않는 것으로 나타났습니다(그림 4i 및 보충 그림 4h).).종합하면, 우리의 결과는 DARS-AS1이 PACT 매개 PKR 활성화를 억제함으로써 적어도 부분적으로 세포 증식을 촉진함을 시사합니다.
종양 형성에서 DARS-AS1의 역할을 더 탐구하기 위해 우리는 마우스 이종이식 모델을 사용하여 생체 내 실험을 수행했습니다. 결과는 DARS-AS1의 녹다운이 마우스에서 종양 성장을 극적으로 감소시켰음을 보여줍니다(p 값 < 0.0001)(그림 5a). 결과는 DARS-AS1의 녹다운이 마우스에서 종양 성장을 극적으로 감소시켰음을 보여줍니다(p 값 < 0.0001)(그림 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (р) 결과는 DARS-AS1 녹다운이 마우스에서 종양 성장을 크게 감소시킨다는 것을 보여줍니다(p 값 < 0.0001)(그림 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р) (значение р) <0,0001 결과는 DARS-AS1 녹다운이 마우스에서 종양 성장을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났습니다(p 값 < 0.0001)(그림 5a).따라서 DARS-AS1 녹다운 그룹에서 평균 종양 부피는 약 72.9%, 평균 종양 질량은 약 87.8% 감소했습니다(그림 5b-d).이러한 결과는 DARS-AS1이 생체 내에서 종양 성장을 유의하게 촉진할 수 있음을 강력하게 시사합니다.
누드 마우스에서 결장직장 종양 발생에 대한 ad DARS-AS1 녹다운의 효과.성장 곡선(a), 종양 크기(b), 무게(c) 및 종양 이미지(d)가 표시됩니다.오차 막대는 ±SEM을 나타냅니다. n = 10. ****p < 0.0001, 양측 스튜던트 t 검정에 의해. n = 10. ****p < 0.0001, 양측 스튜던트 t 검정에 의해. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 양측 스튜던트 t-검정.n = 10. ****p < 0.0001，통过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 양측 스튜던트 t-검정.e Kaplan-Meier는 UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM 및 LGG 환자에서 DARS-AS1 발현 수준과 전체 생존 간의 상관 관계를 분석했습니다.환자에서 높은 수준의 DARS-AS1 발현은 상위 50%에 속했습니다.환자에서 낮은 수준의 DARS-AS1 발현은 하위 50%에 있었습니다.p-값은 로그 순위 테스트를 사용하여 결정되었습니다.f DARS-AS1이 PACT-PKR 경로와 종양 성장을 조절하는 제안된 모델.
DARS-AS1의 임상적 영향을 더 잘 이해하기 위해 발현과 환자 생존 간의 상관관계를 조사했습니다.TCGA 데이터 세트를 분석함으로써, 우리는 더 높은 DARS-AS1 발현이 포도막 흑색종(UVM), 신장 발색 공포증(KICH), 신장 유두 세포 암종(KIRP), 중피종(MESO), 다중과 관련이 있음을 발견했습니다.낮은 생존율은 교모세포종 형태증(GBM) 및 저등급 뇌 교종(LGG) 환자와 유의하게 연관되었습니다(그림 5e).이러한 결과는 DARS-AS1이 임상 종양 진행에서 중요한 역할을 할 수 있고 여러 암에서 잠재적인 예측 바이오마커가 될 수 있음을 시사합니다.
이 연구에서 우리는 대규모 CRISPRi 기능 스크리닝을 사용하여 DARS-AS1 lncRNA가 두 가지 주요 스트레스 반응자 PACT와 PKR을 조절하여 암세포 스트레스를 극복한다는 것을 확인했습니다.DARS-AS1은 PACT와 직접 상호 작용하여 PACT 매개 PKR 활성화를 억제하여 세포 사멸을 방지하고 세포 증식을 촉진합니다(그림 5f).DARS-AS1의 상향 조절은 여러 유형의 암에서 관찰되었으며, 이는 스트레스가 많은 조건에서 암세포 생존을 촉진하는 기능이 여러 유형의 암에 광범위하게 적용될 수 있음을 시사합니다.
PACT는 PKR 활성화 단백질로 확인되었으며 PACT 매개 PKR 활성화는 전사, 번역, 세포자멸사 및 기타 중요한 세포 과정을 조절함으로써 스트레스 반응에서 중요한 역할을 합니다.수십 년 동안 PACT-PKR 캐스케이드의 암 특이적 조절을 이해하려는 시도가 있었습니다.여기에서 우리 연구는 PACT에 직접 결합하고 PACT-PKR 상호 작용을 차단하고 PKR 활성화 및 eIF2α 인산화를 억제하여 스트레스 유발 세포 사멸을 억제하고 궁극적인 암 증식을 자극합니다.세포.이 발견은 암 예후 및 치료를 위한 잠재적인 lncRNA 표적에 빛을 비춰줍니다.
우리의 데이터는 DARS-AS1 녹다운이 인산화된 PKR 및 eIF2α의 상당한 증가와 함께 세포를 혈청 기아에 민감하게 만든다는 것을 보여주었습니다.이러한 결과는 DARS-AS1이 PACT/PKR 활성을 억제함으로써 가혹한 조건에서 암세포 생존을 촉진함을 시사한다.ASPACT 및 nc886과 같은 여러 다른 비암호화 RNA도 PACT48 mRNA를 하향 조절하거나 PKR49,50,64에 결합하여 자가인산화를 조절함으로써 PACT/PKR 축에 관여합니다.그 중 DARS-AS1은 PACT-PKR 연합을 교란시키는 역할을 한다.이 연구는 PACT/PKR 축 조절과 스트레스 반응에서 lncRNA의 역할에 대한 우리의 이해를 풍부하게 합니다.
PACT에는 세 개의 개별 도메인이 있습니다.처음 두 개의 dsRBD 각각은 PACT와 PKR의 높은 친화력 결합을 달성하는 데 충분하지만 세 번째 도메인(D3)은 시험관내 및 생체내 PKR 활성화에 필요합니다.우리의 연구는 DARS-AS1이 D3 도메인과 우선적으로 상호작용한다는 것을 보여주었습니다(그림 3h).lncRNA(768 뉴클레오티드)의 큰 크기를 감안할 때 D3에 결합하는 DARS-AS1은 dsRBD의 PACT 도메인과 PKR 사이의 상호작용을 물리적으로 억제하여 PACT와 PKR의 결합을 차단할 수 있습니다.D3의 Ser246 및 Ser287을 알라닌 또는 아스파르트산염으로 대체한 PACT 점 돌연변이는 DARS-AS1에 대한 결합 친화력을 방해하여 D3의 전반적인 구조적 및 전기적 특성이 연관되어 있음을 나타냅니다.이 메커니즘에 대한 자세한 내용은 앞으로 더 정밀한 생화학적 분석과 고해상도 PACT 구조 분석을 사용하여 요구될 것입니다.
이전 연구에서는 DARS-AS1이 여러 메커니즘을 통해 세포 증식을 촉진한다고 보고했습니다51,52,53.한 예에서 연구자들은 DARS-AS1이 신장암 세포에서 miP-194-5p를 표적으로 하여 안티센스 단백질을 암호화하는 DARS 유전자를 상향조절한다는 것을 관찰했습니다.그러나 현재 연구에서 DARS-AS1 녹다운은 적어도 결장직장암, 유방암 및 간암을 포함한 여러 유형의 암에서 DARS 전사에 거의 영향을 미치지 않았습니다.lncRNA는 세포 및 조직 특이적 발현 패턴을 나타내기 때문에 암 유형에 따라 기능적 메커니즘이 보존되지 않을 수 있으며, 이는 우리의 관찰과 다른 암에 대한 이전 평가 사이의 불일치에 기여할 수 있습니다.다양한 생리적 및 병리학적 과정의 특정 기전을 밝히기 위해서는 특별한 연구가 필요합니다.
임상 데이터 분석에 따르면 종양에서의 DARS-AS1 발현은 암 환자의 생존과 반비례하여 암 예후에서 DARS-AS1/PACT/PKR 축의 중요성을 강조합니다.결론적으로, 우리 연구는 DARS-AS1이 PACT/PKR 신호전달 축의 조절자이고, 암 세포 증식을 촉진하고, 스트레스 반응 동안 세포자멸사를 억제한다는 것을 보여주며, 이는 또 다른 연구 라인을 제공하고 잠재적 치료법에 대한 향후 연구에 관심이 있습니다. .
인간 세포주 SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 및 HEK293T는 중국의 국가 세포주 자원 기반 시설에서 입수했습니다.모든 세포는 37°C, 5% CO2에서 10% FBS(Gemini, Brooklyn, NY) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 DMEM 배지(DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 유지되었습니다.부란기.
Anti-PACT, Abcam(ab31967);항-PKR, Abcam(ab184257);항-PKR(phospho-T451), Abcam(ab81303);Anti-Flag, Abcam(ab125243);항-eIF2α, Abcam(A0764)) ;항-eIF2α(인 S51), Abcam(ab32157);항-PACT(인 S246), Abgent(AP7744b);항-β-튜불린, CST(2128);정상 마우스 IgG, CST(5415S);정상 토끼 IgG, CST(2729S).항체는 웨스턴 블롯팅의 경우 PBST에서 1:1000, IP의 경우 1:100으로 희석되었습니다.
sgRNA는 CRISPR-ERA66이라는 공개 도구를 사용하여 개발되었습니다.우리는 sgRNA 개발을 위한 기본 도구 매개변수와 3kb 영역에서 sgRNA 결합 부위를 계산한 알고리즘을 사용했습니다.TSS를 중심으로sgRNA 올리고뉴클레오티드 풀을 CustomArray, Inc.(Bothewell, WA)에서 합성하고 인간화 pgRNA 플라스미드(Addgene #44248)에 클로닝했습니다.총 12 µg의 풀링된 인간화 pgRNA 플라스미드, 7.2 µg의 psPAX2(Addgene #12260) 및 4.8 µg의 pMD2.G(Addgene #12259)를 DNAfect Transfection Reagent 10 cm 접시에서 5 x 106 HEK293T로 공동 형질감염했습니다. 제조사의 지시에 따라 cell(CWBIO, Beijing, China)을 사용합니다.바이러스 함유 상등액을 형질감염 48시간 및 72시간 후에 수집하고 0.45μm 필터를 통해 여과하였다.스크리닝을 위해 dCas9/KRAB 융합 단백질을 발현하는 SW620 세포를 바이러스 형질도입을 통해 얻었다.변형된 SW620 세포는 0.1-0.3의 MOI에서 4개의 독립적인 감염 실험에서 바이러스 라이브러리로 감염되었고 2일 동안 2㎍/ml 퓨로마이신(Sigma, St. Louis, MO)으로 샘플링되었습니다.그 후, 세포를 스크리닝을 위해 500개 세포/sgRNA의 최소 라이브러리 적용 범위로 시험관 내에서 18일 동안 배양했습니다.
게놈 DNA는 QIAamp DNA Blood Midi Kit(QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183)의 지침에 따라 추출되었습니다.라이브러리를 구축하는 데 생물학적 반복당 총 100μg의 게놈 DNA가 사용되었습니다.sgRNA 영역은 2회의 PCR에 의해 증폭되었고 바코드에 연결되었습니다.
PCR 산물은 NucleoSpin® 겔 및 PCR 정제 키트(MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250)를 사용하여 정제하고 Qubit™ HS 이중 가닥 DNA 검출 키트(Thermo Fisher Scientific, Q32854)를 사용하여 정량화했습니다.
MTS 분석은 세포 증식을 측정하는 데 사용되었습니다.세포를 2000개 세포/웰의 초기 밀도로 96웰 플레이트에 접종하였다.세포의 상대 수는 총 4-6일 동안 표시된 시간에 매일 측정되었습니다.각 웰에 대해 20㎕의 MTS 시약(Promega)을 100㎕의 DMEM으로 희석하고 37℃에서 4시간 동안 세포와 인큐베이션한 후 OD490을 측정하였다.
고정되지 않은 성장의 능력은 구체의 형성을 분석하여 발견되었습니다.간단히 말해서, shRNA DARS-AS1 또는 대조군 shRNA로 형질감염된 2000개의 세포를 4일마다 배지를 교체하면서 초저부착 마이크로플레이트(Corning)에서 배양하였다.스페로이드는 14일 후에 계산되었습니다.DARS-AS1 과발현 플라스미드 또는 대조군 플라스미드로 형질감염된 500개 세포를 강화 분석에 사용했으며, 그렇지 않으면 방법이 변경되지 않았습니다.
RNA는 Riboprobe® Combination Systems(Promega P1440)의 지침에 따라 T7 RNA 중합효소 및 비오틴-16-UTP(Roche 1138908910)를 사용하여 전사되었습니다.여기에 사용된 프라이머는 보충 표 4에 나열되어 있습니다.
단백질 코딩 PACT 또는 PKR 영역을 pET15b(Addgene #73619)에 클로닝하고 BL21(DE3)으로 형질전환했습니다.박테리아를 암피실린이 공급된 LB에서 밤새 배양한 다음 신선한 LB로 100배 희석했습니다.배지의 OD600이 0.8에 도달하면 1mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다.부드럽게 흔들면서 밤새 배양한 후(20°C에서 250rpm), 세포 펠렛을 원심분리(4000rpm, 10분, 4°C)에 의해 수집했습니다.세포 펠릿을 용해 완충액(50mM Tris, pH 8.0, 250mM NaCl, 1mM PMSF)에 재현탁하고 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음 초음파 처리(15분, 5초 켜기/끄기, 얼음 위에서) 및 원심분리기(13,000) rpm)., 30분, 4°C).그런 다음 상층액을 4°C에서 3회 Ni-NTA 수지(QIAGEN)에 로딩하고 세척 완충액(50mM Tris, pH 8.0, 40mM 이미다졸, 250mM NaCl)으로 4회 세척하고 총 3회 용리했습니다. 10ml 용리액 완충액(50mM Tris, pH 8.0, 250mM NaCl, 300mM 이미다졸).정제된 단백질은 WB를 사용하여 결정하고 농도는 Qubit™ 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific; Q 33212)를 사용하여 결정했습니다.
RIP 분석은 수정과 함께 이전에 설명한 대로 수행되었습니다.간단히 말해서, 1x RIP 완충액(25mM Tris-HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin 리보뉴클레아제 억제제(Promega), PMSF(Beyotime Biotechnology), 1mM DDM, 프로테아제)은 1 x 107 칵테일을 용해합니다. (Roche, 1mM DTT) 및 4°C에서 15분 동안 13,000rpm에서 원심분리기.그런 다음 상층액을 5㎍의 항-PACT 항체(Abeam) 또는 IgG(CST)와 접합된 단백질 A+G 자기 비드(Millipore)와 함께 인큐베이션했습니다.비드를 5x RIP 완충액으로 5회 세척한 다음, 프로테이나제 K(NEB)로 분해했습니다.RNA를 Trizol로 추출하고 RT-qPCR로 측정했습니다.프라이머는 보충 표 5에 나와 있습니다.
시험관내 RIP 분석은 수정된 표준 RIP 분석 프로토콜에 따라 수행되었습니다.총 5pmol의 시험관 내 전사된 RNA를 RIP 완충액으로 1x 희석하고 65°C에서 5분 동안 인큐베이션한 후 실온으로 천천히 냉각하여 어닐링했습니다.총 5 pmol의 온전하거나 돌연변이된 플래그 표지된 PACT 단백질이 E. coli에서 정제되었습니다.4°C에서 2시간 동안 재생된 RNA와 함께 인큐베이션하고 안티 플래그 IP에 대한 RIP 분석을 위해 위의 절차를 따릅니다.
RNA 확장 분석을 위해 1x107 세포를 1xRIP 완충액으로 용해했습니다.4°C에서 15분 동안 13,000 rpm에서 원심분리한 후 상층액을 4°C에서 2시간 동안 30 μl의 streptavidin magnetic bead(Beckman)로 전처리했습니다.그런 다음 정제된 용해물에 효모 tRNA를 공급하고 40pmol의 재생된 RNA와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션한 다음 추가로 2시간 동안 인큐베이션하고 BSA로 차단된 새로운 스트렙타비딘 자기 비드 20㎕를 첨가했습니다.세척 단계는 5x RIP 버퍼로 4회 및 1x RIP 버퍼로 4회로 구성되었습니다.상응하는 단백질을 비오틴 용리 완충액(25mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5mM D-비오틴, PMSF)으로 용리하고 NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen)에서 분리하였다.은 염색(Beyotime Biotechnology) 후, 특정 밴드를 절제하고 MS로 분석했습니다.
PACT와 PKR 간의 상호작용을 테스트하기 위해 Co-IP 분석을 수행했습니다.간단히 말해서, 1 x 107 용해된 세포를 1 x RIP 완충액에서 인큐베이션한 후 4°C에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하여 상청액 용해물을 제조했습니다.용해물에 단백질 A + G 자기 비드를 로딩하고, 5㎍의 항-PACT 항체와 접합시키고, 4°C에서 밤새 부드럽게 회전시켰다.비드를 5×RIP 완충액으로 3회, 1×RIP 완충액으로 2회 세척하고, 1×SDS 완충액으로 용리시켰다.회수된 단백질을 SDS-PAGE 겔로 분석하고 WB로 검출하였다.
플래그가 지정된 PACT 2 pmol 및 PKR 1 pmol을 E. coli에서 정제했습니다.1X RIP 버퍼로 희석하고 4°C에서 2시간 동안 10pmol의 재생된 RNA와 함께 배양합니다.그 후, 단백질 A+G 자기 비드가 결합된 항표지 항체와 함께 추가로 2시간 동안 인큐베이션하였다.그런 다음 비드를 1x RIP 완충액으로 4회 세척하고 1x SDS 완충액으로 용리했습니다.결과 PACT 및 PKR은 WB에 의해 감지되었습니다.