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효과적인 감광제는 광선 요법의 광범위한 임상 사용에 특히 중요합니다.그러나, 기존의 감광제는 일반적으로 단파장 흡수, 불충분한 광안정성, 반응성 산소종(ROS)의 낮은 양자 수율, 및 ROS의 응집 유도 소광을 겪는다.여기에서 우리는 수용액에서 Ru(II)-아렌 유기금속 복합체의 자가 조립에 의해 매개되는 근적외선(NIR) 초분자 감광제(RuDA)를 보고합니다.RuDA는 응집된 상태에서 단일항 산소(1O2)만 생성할 수 있으며 단일항-삼중항 시스템 간의 교차 과정이 크게 증가하여 명백한 응집 유발 1O2 생성 거동을 나타냅니다.808 nm 레이저 광의 작용 하에서 RuDA는 16.4%의 1O2 양자 수율(FDA 승인 인도시아닌 그린: ΦΔ=0.2%)과 24.2%의 높은 광열 변환 효율(상업용 금 나노막대)과 우수한 광안정성을 나타냅니다.: 21.0%, 금 나노쉘: 13.0%).또한 생체 적합성이 우수한 RuDA-NP는 종양 부위에 우선적으로 축적되어 생체 내에서 종양 부피가 95.2% 감소하는 광역학 요법 동안 상당한 종양 퇴행을 유발할 수 있습니다.이 응집 강화 광역학 요법은 유리한 광물리 및 광화학적 특성을 가진 감광제를 개발하기 위한 전략을 제공합니다.
PDT(Photodynamic Therapy)는 기존 치료법과 비교하여 정확한 시공간 제어, 비침습성, 무시할 수 있는 약물 내성 및 부작용 최소화와 같은 상당한 이점으로 인해 암에 대한 매력적인 치료법입니다1,2,3.빛 조사 하에서 사용된 감광제는 활성화되어 반응성이 높은 산소 종(ROS)을 형성하여 세포자멸사/괴사 또는 면역 반응을 유발할 수 있습니다. 그러나 클로린, 포르피린, 안트라퀴논과 같은 대부분의 기존 감광제는 상대적으로 짧은 파장 흡수(주파수 < 680 nm)를 가지므로 생체 분자(예: 헤모글로빈 및 멜라닌)의 강한 흡수로 인해 빛 투과율이 좋지 않습니다. 가시 영역6,7. 그러나 클로린, 포르피린, 안트라퀴논과 같은 대부분의 기존 감광제는 상대적으로 짧은 파장 흡수(주파수 < 680 nm)를 가지므로 생체 분자(예: 헤모글로빈 및 멜라닌)의 강한 흡수로 인해 빛 투과율이 좋지 않습니다. 가시 영역6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. 그러나 클로린, 포르피린 및 안트라퀴논과 같은 가장 일반적인 감광제는 생물학적 분자(예: 헤모글로빈 및 멜라닌)가 가시 영역으로 강력하게 흡수되기 때문에 상대적으로 짧은 파장 흡수(< 680 nm)로 인해 빛 투과가 불량합니다.然而 然而, 大多数 ， 的 光敏剂 光敏剂 光敏剂 光敏剂 氢 氢 氢 卟酚 卟啉 卟啉 和 和 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 较 较 短 的 波长 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 (频率 <680 nm 찾고 因此 由于 对 对 生物 分子 分子 分子 分子 如 血红 蛋白 蛋白 和 黑色素 强烈 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 生物 生物 生物 生物 生物.导致光穿透性差。然而 然而, 大多数 ， 的 光敏剂 光敏剂 光敏剂 光敏剂 、 、 、 卟啉 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 蒽醌 较 较 较 短 的 波长 吸收 吸收 吸收 吸收 频率 <680 nm 찾고 因此 由于 由于 对 对 分子 分子）））））））））））））））吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. 그러나, 클로린, 포르피린 및 안트라퀴논과 같은 대부분의 전통적인 감광제는 헤모글로빈 및 멜라닌과 같은 생체 분자의 강한 흡수로 인해 상대적으로 짧은 파장 흡수(주파수 < 680 nm)를 가지므로 빛 투과가 불량합니다.가시 영역 6.7.따라서 700-900 nm "치료 창"에서 활성화되는 근적외선(NIR) 흡수 감광제는 광선 요법에 적합합니다.근적외선은 생물학적 조직에 가장 적게 흡수되기 때문에 더 깊은 침투로 이어질 수 있고 광손상이 적습니다.
불행히도 기존 NIR 흡수 감광제는 일반적으로 광안정성이 낮고 일중항 산소(1O2) 생성 용량이 낮고 응집 유발 1O2 소광이 있어 임상 적용이 제한됩니다10,11.기존의 감광제의 광물리적 및 광화학적 특성을 개선하기 위해 많은 노력이 있었지만 지금까지 NIR 흡수 감광제가 이러한 모든 문제를 해결할 수 있다는 여러 보고서가 보고되었습니다.또한, 몇몇 감광제는 근적외선 영역에서 광자 에너지가 급격히 감소하기 때문에 800nm ​​이상의 빛으로 조사될 때 1O212,13,14의 효율적인 생성에 대한 가능성을 보여주었습니다.전자 공여체로서의 트리페닐아민(TFA) 및 전자 수용체 기로서의 [1,2,5]티아디아졸-[3,4-i]디피리도[a,c]페나진(TDP) 공여체 수용체(DA) 유형 염료 근적외선 바이오이미징 II 및 광열 요법(PTT)에 대해 광범위하게 연구되어온 근적외선 흡수 염료의 좁은 밴드갭으로 인해.따라서 DA형 염료는 근적외선 여기가 있는 PDT에 사용할 수 있지만 PDT의 감광제로는 거의 연구되지 않았습니다.
감광제의 높은 ISC(intersystem crossing) 효율이 1O2의 형성을 촉진한다는 것은 잘 알려져 있습니다.ISC 공정을 발전시키기 위한 일반적인 전략은 무거운 원자 또는 특수 유기 부분을 도입하여 감광제의 SOC(spin-orbit coupling)를 향상시키는 것입니다.그러나 이 접근 방식에는 여전히 몇 가지 단점과 한계가 있습니다19,20.최근에, 초분자 자가 조립은 광선 요법에서 수많은 이점을 가진 분자 수준에서 기능성 물질의 제조를 위한 상향식 지능형 접근 방식을 제공했습니다. (1) 자가 조립된 감광제는 리본 구조를 형성할 가능성이 있습니다.빌딩 블록 사이의 중첩 궤도로 인해 에너지 준위가 더 조밀하게 분포된 전자 구조와 유사합니다.따라서, 하부 단일항 여기 상태(S1)와 이웃하는 삼중항 여기 상태(Tn) 사이의 에너지 정합이 개선될 것이며, 이는 ISC 공정(23, 24)에 유리하다.(2) 초분자 어셈블리는 또한 ISC 프로세스 25, 26을 촉진하는 분자내 운동 제한 메커니즘(RIM)을 기반으로 하는 비방사성 이완을 감소시킵니다.(3) 초분자 집합체는 단량체의 내부 분자를 산화 및 분해로부터 보호하여 감광제의 광안정성을 크게 향상시킬 수 있습니다.위의 장점을 감안할 때 우리는 초분자 감광제 시스템이 PDT의 단점을 극복하는 유망한 대안이 될 수 있다고 믿습니다.
Ru(II) 기반 복합체는 독특하고 매력적인 생물학적 특성으로 인해 질병 진단 및 치료에 잠재적으로 응용할 수 있는 유망한 의료 플랫폼입니다28,29,30,31,32,33,34.또한 Ru(II) 기반 복합체의 풍부한 여기 상태와 조정 가능한 광 물리화학적 특성은 Ru(II) 기반 감광제 개발에 큰 이점을 제공합니다.주목할만한 예는 루테늄(II) 폴리피리딜 복합체 TLD-1433으로, 현재 비근육 침습성 방광암(NMIBC)41 치료를 위한 감광제로 임상 2상 시험을 진행하고 있습니다.또한 루테늄(II)아렌 유기금속 착물은 독성이 낮고 변형이 용이하여 암 치료를 위한 화학요법제로 널리 사용됩니다42,43,44,45.Ru(II)-아렌 유기금속 착물의 이온 특성은 일반 용매에서 DA 발색단의 낮은 용해도를 개선할 뿐만 아니라 DA 발색단의 조립도 개선할 수 있습니다.또한, Ru(II)-아렌의 유기금속 착물의 pseudooctahedral half-sandwich 구조는 DA형 발색단의 H-응집을 입체적으로 방지할 수 있으며, 따라서 적색편이된 흡수 밴드를 갖는 J-응집의 형성을 촉진할 수 있습니다.그러나 낮은 안정성 및/또는 낮은 생체이용률과 같은 Ru(II)-아렌 복합체의 고유한 단점은 치료 효능 및 아렌-Ru(II) 복합체의 생체 내 활성에 영향을 미칠 수 있습니다.그러나 연구에 따르면 루테늄 착물을 물리적 캡슐화 또는 공유 접합에 의해 생체 적합성 중합체로 캡슐화함으로써 이러한 단점을 극복할 수 있음이 밝혀졌습니다.
이 작업에서 우리는 DAD 발색단과 Ru(II)-아렌 모이어티 사이의 배위 결합을 통해 NIR 트리거가 있는 Ru(II)-아렌(RuDA)의 DA-공액 복합체를 보고합니다.생성된 복합체는 비공유 상호작용으로 인해 물에서 금속초분자 소포로 자가 조립될 수 있습니다.특히, 초분자 어셈블리는 RuDA에 중합 유도 시스템 간 교차 특성을 부여하여 ISC 효율성을 크게 증가시켜 PDT에 매우 유리했습니다(그림 1A).종양 축적 및 생체 내 생체 적합성을 증가시키기 위해 FDA 승인 Pluronic F127(PEO-PPO-PEO)을 사용하여 RuDA47,48,49를 캡슐화하여 고효율 PDT/Dual- 모드 PTT 프록시 .암 광선 요법(그림 1C)에서 RuDA-NP는 생체 내 PDT 및 PTT의 효능을 연구하기 위해 MDA-MB-231 종양이 있는 누드 마우스를 치료하는 데 사용되었습니다.
암 광선 요법, NIR 활성화 PDT 및 PTT에 대한 B RuDA-NP 및 C RuDA-NP의 합성을 위한 단량체 및 응집 형태의 RuDA의 광물리적 메커니즘의 개략도.
TPA 및 TDP 기능으로 구성된 RuDA는 보충 그림 1(그림 2A)에 표시된 절차에 따라 준비되었으며 RuDA는 1H 및 13C NMR 스펙트럼, 전자 분무 이온화 질량 분석기 및 원소 분석으로 특성화되었습니다(보충 그림 2-4 ).가장 낮은 단일항 전이의 RuDA 전자 밀도 차이 맵은 전하 이동 과정을 연구하기 위해 시간 종속 밀도 기능 이론(TD-DFT)에 의해 계산되었습니다.보충 그림 5에 표시된 것처럼 전자 밀도는 광여기 후 주로 트리페닐아민에서 TDP 수용체 단위로 드리프트하며, 이는 일반적인 분자내 전하 이동(CT) 전이에 기인할 수 있습니다.
광석의 화학 구조 B 다양한 비율의 DMF와 물의 혼합물에서 광석의 흡수 스펙트럼.C RuDA(800 nm) 및 ICG(779 nm)의 정규화된 흡수 값 대 시간 808 nm 레이저 광의 0.5 W cm-2.D ABDA의 광분해는 808 nm의 파장과 0.5 W/cm2의 출력을 가진 레이저 방사선의 작용 하에서 수분 함량이 다른 DMF/H2O 혼합물에서 RuDA에 의해 유도된 1O2로 나타납니다.
초록—UV-가시광 흡수 분광법은 다양한 비율의 DMF와 물의 혼합물에서 광석의 자기 조립 특성을 연구하는 데 사용되었습니다.그림과 같이.도 2b에서, RuDA는 729 nm에서 최대 흡수 대역과 함께 DMF에서 600 내지 900 nm의 흡수 대역을 나타낸다.물의 양을 늘리면 광석 흡수 최대값이 800nm까지 점진적으로 적색 이동이 일어나며, 이는 조립된 시스템에서 광석의 J-응집을 나타냅니다.다른 용매에서 RuDA의 광발광 스펙트럼은 보충 그림 6에 나와 있습니다. RuDA는 최대 방출 파장이 ca인 전형적인 NIR-II 발광을 나타내는 것으로 보입니다.CH2Cl2 및 CH3OH에서 각각 1050 nm.RuDA의 큰 스톡스 이동(약 300nm)은 여기 상태의 기하학적 구조와 저에너지 여기 상태의 형성에 상당한 변화가 있음을 나타냅니다.CH2Cl2와 CH3OH에서 광석의 발광 양자 수율은 각각 3.3%와 0.6%로 결정되었다.그러나 메탄올과 물의 혼합물(5/95, v/v)에서 방출의 약간의 적색편이와 양자 수율의 감소(0.22%)가 관찰되었으며, 이는 광석의 자가 조립으로 인한 것일 수 있습니다. .
ORE의 자가 조립을 시각화하기 위해 액체 원자간력 현미경(AFM)을 사용하여 물을 추가한 후 메탄올 용액에서 ORE의 형태학적 변화를 시각화했습니다.수분 함량이 80% 미만이면 명확한 응집이 관찰되지 않았습니다(보충 그림 7).그러나 수분 함량이 90-95%로 추가 증가함에 따라 작은 나노 입자가 나타나 광석의 자체 조립을 나타냈습니다. 솔루션(그림 2C 및 보충 그림 8).대조적으로, 인도시아닌 그린(대조군으로서 ICG)의 흡광도는 779 nm에서 급격히 감소하여 RuDA의 우수한 광안정성을 나타냅니다.또한 PBS(pH = 5.4, 7.4 및 9.0), 10% FBS 및 DMEM(고포도당)에서 RuDA-NPs의 안정성을 다양한 시점에서 UV-가시광선 흡수 분광법으로 조사했습니다.보충 그림 9에서 볼 수 있듯이 pH 7.4/9.0의 PBS, FBS 및 DMEM에서 RuDA-NP 흡수 밴드의 약간의 변화가 관찰되어 RuDA-NP의 우수한 안정성을 나타냅니다.그러나 산성 매질(рН = 5.4)에서 광석의 가수분해가 발견되었습니다.또한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법을 사용하여 RuDA 및 RuDA-NP의 안정성을 추가로 평가했습니다.보충 그림 10에서 볼 수 있듯이 RuDA는 메탄올과 물의 혼합물(50/50, v/v)에서 처음 1시간 동안 안정했고 4시간 후에 가수분해가 관찰되었습니다.그러나 RuDA NP에서는 넓은 요철 피크만 관찰되었습니다.따라서 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 사용하여 PBS(pH = 7.4)에서 RuDA NP의 안정성을 평가했습니다.보충 그림 11에서 볼 수 있듯이 테스트 조건에서 8시간 배양 후 NP RuDA의 피크 높이, 피크 너비 및 피크 면적은 크게 변하지 않았으며, 이는 NP RuDA의 우수한 안정성을 나타냅니다.또한, TEM 이미지는 RuDA-NP 나노 입자의 형태가 희석된 PBS 완충액(pH = 7.4, 보충 그림 12)에서 24시간 후에도 거의 변하지 않은 상태로 유지되었음을 보여주었습니다.
자가 조립은 광석에 다른 기능적 및 화학적 특성을 부여할 수 있기 때문에 메탄올-물 혼합물에서 9,10-안트라센디일비스(메틸렌)디말론산(ABDA, 지시약 1O2)의 방출을 관찰했습니다.수분 함량이 다른 광석50.그림 2D 및 보충 그림 13에서 볼 수 있듯이 수분 함량이 20% 미만일 때 ABDA의 분해는 관찰되지 않았습니다.습도가 40%로 증가함에 따라 ABDA 형광 강도의 감소에 의해 입증된 바와 같이 ABDA 분해가 발생했습니다.또한 수분 함량이 높을수록 분해가 더 빨라지는 것으로 관찰되었으며, 이는 RuDA 자체 조립이 ABDA 분해에 필요하고 유익함을 시사합니다.이 현상은 현대 ACQ(응집 유도 소광) 발색단과 매우 다릅니다.808 nm 파장의 레이저를 조사할 때 98% H2O/2% DMF의 혼합물에서 1O2 RuDA의 양자 수율은 16.4%로 ICG(ΦΔ = 0.2%)보다 82배 더 높습니다. 응집 상태에서 놀라운 발전 효율 1O2 RuDA를 보여줍니다.
스핀 트랩으로 2,2,6,6-테트라메틸-4-피페리디논(TEMP) 및 5,5-디메틸-1-피롤린 N-옥사이드(DMPO)를 사용하는 전자 스핀 공명 분광법(ESR)을 사용하여 생성된 종을 식별했습니다. AFK.RuDA에 의해.보충 그림 14와 같이 조사 시간 0~4분에서 1O2가 발생함을 확인하였다.또한, RuDA를 조사 하에 DMPO와 함께 배양할 때, 1:2:2:1 DMPO-OH· 부가물의 전형적인 4선 EPR 신호가 검출되어 수산기 라디칼(OH·)의 형성을 나타냅니다.전반적으로 위의 결과는 이중 유형 I/II 광감작 과정을 통해 ROS 생성을 자극하는 RuDA의 능력을 보여줍니다.
단량체 및 응집체 형태의 RuDA의 전자적 특성을 더 잘 이해하기 위해 DFT 방법을 사용하여 단량체 및 이량체 형태의 RuDA의 프론티어 분자 궤도를 계산했습니다.그림과 같이.도 3a에서, 단량체 RuDA의 최고 점유 분자 궤도(HOMO)는 리간드 백본을 따라 비편재화되고 최저 비점유 분자 궤도(LUMO)는 TDP 수용체 단위를 중심으로 한다.반대로, 이량체 HOMO의 전자 밀도는 한 RuDA 분자의 리간드에 집중되어 있는 반면, LUMO의 전자 밀도는 주로 다른 RuDA 분자의 수용체 단위에 집중되어 있어 RuDA가 이량체에 있음을 나타냅니다.CT의 특징.
A 광석의 HOMO 및 LUMO는 단량체 및 이량체 형태로 계산됩니다.B 단량체 및 이량체에서 광석의 단일항 및 삼중항 에너지 준위.C RuDA 및 가능한 ISC 채널의 예상 수준은 단량체 C 및 이량체 D입니다. 화살표는 가능한 ISC 채널을 나타냅니다.
TD-DFT 방법을 사용하여 계산된 Multiwfn 3.852.53 소프트웨어를 사용하여 단량체 및 이량체 형태의 RuDA의 저에너지 단일항 여기 상태에서 전자 및 정공의 분포를 분석했습니다.추가 라벨에 표시된 대로.그림 1-2에서 볼 수 있듯이, 단량체 RDA 정공은 이러한 단일항 여기 상태에서 리간드 백본을 따라 대부분 비편재화되는 반면 전자는 대부분 TDP 그룹에 위치하여 CT의 분자내 특성을 보여줍니다.또한, 이러한 단일항 여기 상태의 경우 정공과 전자 사이에 다소간의 중첩이 있는데, 이는 이러한 단일항 여기 상태가 국부 여기(LE)에서 일부 기여함을 시사합니다.이량체의 경우, 분자간 CT 및 LE 특징 이외에, CT 분자간 전이를 주요 특징으로 하는 분자간 CT 분석에 기초하여, 각 상태, 특히 S3, S4, S7 및 S8에서 특정 비율의 분자간 CT 특징이 관찰됨 (보충 표).삼).
실험 결과를 더 잘 이해하기 위해 RuDA 여기 상태의 특성을 추가로 탐색하여 단량체와 이량체의 차이점을 탐색했습니다(보충 표 4-5).그림 3B에서 볼 수 있듯이 이량체의 단일항 및 삼중항 여기 상태의 에너지 준위는 단량체의 에너지 준위보다 훨씬 밀도가 높기 때문에 S1과 Tn 사이의 에너지 갭을 줄이는 데 도움이 됩니다. ISC 전이는 S1과 Tn54 사이의 작은 에너지 갭(ΔES1-Tn < 0.3 eV) 내에서 실현될 수 있다고 보고되었습니다. ISC 전이는 S1과 Tn54 사이의 작은 에너지 갭(ΔES1-Tn < 0.3 eV) 내에서 실현될 수 있다고 보고되었습니다. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щетической щели (0ES) ISC 전이는 S1과 Tn54 사이의 작은 에너지 갭(ΔES1-Tn <0.3 eV) 내에서 실현될 수 있다고 보고되었습니다.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой 5 энергетической щели (ΔES1) ISC 전이는 S1과 Tn54 사이의 작은 에너지 갭(ΔES1-Tn < 0.3 eV) 내에서 실현될 수 있다고 보고되었습니다.또한, 0이 아닌 SOC 적분을 제공하려면 하나의 오비탈(점유 또는 비점유)만이 결합된 단일항 및 삼중항 상태에서 달라야 합니다.따라서 여기 에너지 및 궤도 전이의 분석을 기반으로 ISC 전이의 모든 가능한 채널이 그림 1 및 2에 나와 있습니다.3C,D.특히, 단량체에는 하나의 ISC 채널만 사용할 수 있지만 이량체 형태에는 ISC 전환을 향상시킬 수 있는 4개의 ISC 채널이 있습니다.따라서 RuDA 분자가 더 많이 모일수록 ISC 채널에 더 쉽게 접근할 수 있다고 가정하는 것이 합리적입니다.따라서 RuDA 집합체는 단일항 및 삼중항 상태에서 2밴드 전자 구조를 형성하여 S1과 사용 가능한 Tn 사이의 에너지 갭을 줄여 ISC의 효율성을 높여 1O2 생성을 촉진할 수 있습니다.
기본 메커니즘을 추가로 설명하기 위해 RuDA에서 두 개의 에틸 그룹을 두 개의 트리페닐아민 페닐 그룹으로 대체하여 아렌-Ru(II) 복합체(RuET)의 참조 화합물을 합성했습니다(그림 4A, 전체 특성은 ESI, 보충 15 참조). -21) 공여체(디에틸아민)에서 수용체(TDF)까지 RuET는 RuDA와 동일한 분자내 CT 특성을 갖는다.예상대로 DMF에서 RuET의 흡수 스펙트럼은 600-1100 nm 영역의 근적외선 영역에서 강한 흡수와 함께 낮은 에너지 전하 전달 대역을 보여주었다(그림 4B).또한, RuET 응집은 수분 함량이 증가함에 따라 관찰되었으며, 이는 흡수 최대값의 적색 편이에 반영되었으며, 이는 액체 AFM 이미징에 의해 추가로 확인되었습니다(보충 그림 22).결과는 RuDA와 마찬가지로 RuET가 분자내 상태를 형성하고 응집된 구조로 자가 조립될 수 있음을 보여줍니다.
RuET의 화학 구조.B 다양한 비율의 DMF와 물의 혼합물에서 RuET의 흡수 스펙트럼.RuDA 및 RuET에 대한 C EIS Nyquist를 플롯합니다.808 nm의 파장을 가진 레이저 방사선의 작용 하에서 RuDA와 RuET의 광전류 응답 D.
RuET 존재하에서 ABDA의 광분해는 808 nm 파장의 레이저 조사에 의해 평가되었다.놀랍게도 다양한 물 분획에서 ABDA의 분해가 관찰되지 않았습니다(보충 그림 23).가능한 이유는 에틸 사슬이 효율적인 분자간 전하 이동을 촉진하지 않기 때문에 RuET가 밴드형 전자 구조를 효율적으로 형성할 수 없기 때문입니다.따라서 RuDA와 RuET의 광전기화학적 특성을 비교하기 위해 전기화학적 임피던스 분광법(EIS)과 과도 광전류 측정을 수행하였다.Nyquist 플롯(그림 4C)에 따르면 RuDA는 RuET보다 훨씬 작은 반경을 나타내며, 이는 RuDA56이 분자간 전자 수송이 더 빠르고 전도성이 더 우수함을 의미합니다.또한, RuDA의 광전류 밀도는 RuET보다 훨씬 높으며(그림 4D), RuDA57의 더 나은 전하 전달 효율을 확인시켜줍니다.따라서 광석에서 트리페닐아민의 페닐기는 분자간 전하 이동 및 밴드형 전자 구조 형성에 중요한 역할을 합니다.
종양 축적 및 생체 내 생체 적합성을 증가시키기 위해 F127로 RuDA를 추가로 캡슐화했습니다.RuDA-NPs의 평균 유체역학적 직경은 투과성 및 유지를 증가시켜 종양 축적을 촉진한 동적 광산란(DLS) 방법(그림 5A)을 사용하여 좁은 분포(PDI = 0.089)로 123.1 nm로 결정되었습니다.EPR) 효과.TEM 이미지는 광석 나노입자가 평균 직경이 86 nm인 균일한 구형을 가지고 있음을 보여주었다.특히 RuDA-NP의 최대 흡수는 800nm에서 나타났으며(보충 그림 24), 이는 RuDA-NP가 자가 조립 RuDA의 기능과 특성을 유지할 수 있음을 나타냅니다.NP 광석에 대해 계산된 ROS 양자 수율은 광석에 필적하는 15.9%입니다.RuDA NPs의 광열 특성은 적외선 카메라를 사용하여 파장 808nm의 레이저 방사선의 작용하에 연구되었습니다.그림과 같이.도 5B,C에서, 대조군(PBS만)은 약간의 온도 상승을 경험한 반면, RuDA-NPs 용액의 온도는 온도(ΔT)가 15.5, 26.1 및 43.0°C로 증가함에 따라 급격히 증가했습니다.높은 농도는 각각 25, 50 및 100 μM으로 RuDA NP의 강력한 광열 효과를 나타냅니다.또한 RuDA-NP의 광열 안정성을 평가하고 ICG와 비교하기 위해 가열/냉각 사이클을 측정했습니다.광석 NP의 온도는 5회의 가열/냉각 주기 후에도 감소하지 않았으며(그림 5D), 이는 광석 NP의 우수한 광열 안정성을 나타냅니다.대조적으로, ICG는 동일한 조건에서 광열 온도 안정기의 명백한 소멸에서 볼 수 있듯이 더 낮은 광열 안정성을 나타냅니다.이전 방법58에 따르면 RuDA-NP의 광열 변환 효율(PCE)은 24.2%로 계산되었으며, 이는 금 나노막대(21.0%) 및 금 나노쉘(13.0%)59과 같은 기존 광열 재료보다 높습니다.따라서 NP 광석은 우수한 광열 특성을 나타내어 유망한 PTT 에이전트입니다.
RuDA NP의 DLS 및 TEM 이미지 분석(삽입).B 파장 808nm(0.5W cm-2)에서 레이저 방사선에 노출된 다양한 농도의 RuDA NP의 열화상.C 정량 데이터인 다양한 농도의 광석 NP의 광열 변환 곡선.B. D 5개의 가열-냉각 사이클에 걸친 ORE NP 및 ICG의 온도 상승.
MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 RuDA NP의 광세포독성을 시험관내에서 평가하였다.그림과 같이.도 6A, B, RuDA-NPs 및 RuDA는 방사선 조사가 없을 때 무시할만한 세포독성을 나타내어 RuDA-NPs 및 RuDA의 암독성이 더 낮음을 의미한다.그러나 808nm 파장의 레이저에 노출된 후 RuDA와 RuDA NP는 IC50 값(반-최대 억제 농도)이 각각 5.4 및 9.4μM로 MDA-MB-231 암세포에 대해 강한 광세포독성을 나타내어 RuDA-NP와 RuDA는 암 광선 요법에 대한 잠재력을 가지고 있습니다.또한, ROS 스캐빈저인 비타민 C(Vc)가 있는 상태에서 RuDA-NP와 RuDA의 광세포독성을 추가 조사하여 광유도 세포독성에서 ROS의 역할을 설명했습니다.분명히, Vc 첨가 후 세포 생존율이 증가했고 RuDA 및 RuDA NP의 IC50 값은 각각 25.7 및 40.0 μM이었으며, 이는 RuDA 및 RuDA NP의 광세포 독성에서 ROS의 중요한 역할을 증명합니다.칼세인 AM(생세포에 대한 녹색 형광) 및 요오드화 프로피듐(PI, 죽은 세포에 대한 적색 형광)을 사용한 생/사 세포 염색에 의한 MDA-MB-231 암세포에서 RuDA-NP 및 RuDA의 광유도 세포독성.세포에 의해 확인됨) 형광 프로브로.도 6C에 도시된 바와 같이, RuDA-NP 또는 RuDA로 처리된 세포는 강렬한 녹색 형광에 의해 입증된 바와 같이 조사 없이 생존 가능한 상태로 유지되었다.반면, 레이저 조사에서는 적색 형광만 관찰되어 RuDA 또는 RuDA 나노입자의 효과적인 광세포독성을 확인하였다.RuDA 및 RuDA NP의 광세포 독성 위반을 나타내는 Vc를 추가하면 녹색 형광이 나타납니다.이러한 결과는 시험관 내 광세포독성 분석과 일치합니다.
Vc(0.5mM)의 존재 또는 부재하에 각각 MDA-MB-231 세포에서 A RuDA- 및 B RuDA-NP 세포의 용량 의존적 생존력.오차 막대, 평균 ± 표준 편차(n = 3). 쌍을 이루지 않은 양측 t 검정 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001. 쌍을 이루지 않은 양측 t 검정 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001.C 칼세인 AM과 요오드화 프로피디움을 형광 프로브로 사용한 살아있는/죽은 세포 염색 분석.스케일 바: 30 μm.각 그룹의 세 가지 생물학적 반복의 대표적인 이미지가 표시됩니다.D 다양한 처리 조건에서 MDA-MB-231 세포에서 ROS 생산의 공초점 형광 이미지.녹색 DCF 형광은 ROS의 존재를 나타냅니다.808 nm 파장의 레이저를 0.5 W/cm2의 출력으로 10분 동안 조사합니다(300 J/cm2).스케일 바: 30 μm.각 그룹의 세 가지 생물학적 반복의 대표적인 이미지가 표시됩니다.E 유세포 분석 RuDA-NPs(50μM) 또는 RuDA(50μM) 처리 분석(808nm 레이저(0.5W cm-2) 유무에 관계없이 Vc(0.5mM)의 존재 및 부재하에 10분 동안.각 그룹의 세 가지 생물학적 반복의 대표적인 이미지가 표시됩니다.808 nm 레이저 조사(0.5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2) 유무에 관계없이 RuDA-NP(50 μM)로 처리된 MDA-MB-231 세포의 F Nrf-2, HSP70 및 HO-1, 세포 발현 2).각 그룹의 두 생물학적 반복의 대표적인 이미지가 표시됩니다.
MDA-MB-231 세포에서 세포 내 ROS 생산은 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA) 염색 방법을 사용하여 조사되었습니다.그림과 같이.도 6d에서, RuDA-NPs 또는 RuDA로 처리된 세포는 808 nm 레이저로 조사되었을 때 뚜렷한 녹색 형광을 나타내어 RuDA-NPs와 RuDA가 ROS를 생성하는 효율적인 능력을 가짐을 나타낸다.이에 반해 빛이 없거나 Vc가 존재하는 경우에는 세포의 약한 형광 신호만 관찰되어 약간의 ROS 형성을 나타내었다.RuDA-NP 세포 및 RuDA 처리된 MDA-MB-231 세포의 세포내 ROS 수준을 유세포 분석에 의해 추가로 결정하였다.보충 그림 25에서 볼 수 있듯이 808 nm 레이저 조사에서 RuDA-NP와 RuDA에 의해 생성된 평균 형광 강도(MFI)는 대조군에 비해 각각 약 5.1배 및 4.8배 크게 증가하여 우수한 형성 AFK를 확인했습니다.용량.그러나 RuDA로 처리된 RuDA-NP 또는 MDA-MB-231 세포의 세포 내 ROS 수준은 공초점 형광 분석 결과와 유사하게 레이저 조사가 없거나 Vc가 있는 대조군과만 유사했습니다.
미토콘드리아가 Ru(II)-아렌 복합체60의 주요 표적인 것으로 나타났습니다.따라서, RuDA 및 RuDA-NPs의 세포내 국소화를 조사하였다.보충 그림 26에서 볼 수 있듯이 RuDA와 RuDA-NP는 미토콘드리아에서 가장 많이 축적된 유사한 세포 분포 프로필을 보여줍니다(각각 62.5 ± 4.3 및 60.4 ± 3.6 ng/mg 단백질).그러나 광석과 NP 광석의 핵 분획에서 소량의 Ru만 발견되었습니다(각각 3.5% 및 2.1%).나머지 세포 분획은 잔류 루테늄을 함유했습니다: RuDA의 경우 31.7%(30.6 ± 3.4ng/mg 단백질), RuDA-NP의 경우 42.9%(47.2 ± 4.5ng/mg 단백질).일반적으로 광석과 NP 광석은 주로 미토콘드리아에 축적됩니다.미토콘드리아 기능 장애를 평가하기 위해 JC-1 및 MitoSOX Red 염색을 사용하여 각각 미토콘드리아 막 잠재력과 과산화물 생산 능력을 평가했습니다.보충 그림 27에서 볼 수 있듯이 808 nm 레이저 조사에서 RuDA와 RuDA-NP로 처리된 세포에서 강렬한 녹색(JC-1)과 빨간색(MitoSOX Red) 형광이 관찰되었으며, 이는 RuDA와 RuDA-NP가 모두 높은 형광성을 나타냄을 나타냅니다. 그것은 미토콘드리아 막 탈분극 및 과산화물 생성을 효과적으로 유도할 수 있습니다.또한, 세포 사멸의 메커니즘은 유세포 분석 기반 annexin V-FITC/propidium iodide(PI) 분석을 사용하여 결정되었습니다.도 6E에 도시된 바와 같이, 808 nm 레이저로 조사될 때, RuDA 및 RuDA-NP는 PBS 또는 PBS + 레이저와 비교하여 MDA-MB-231 세포에서 상당히 증가된 조기 세포자멸사 비율(오른쪽 아래 사분면)을 유도하였다.처리된 세포.그러나 Vc를 첨가했을 때 RuDA와 RuDA-NP의 세포자살률은 각각 50.9%와 52.0%에서 15.8%와 17.8%로 유의하게 감소하여 RuDA와 RuDA-NP의 광세포독성에서 ROS의 중요한 역할을 확인시켜주었다..또한, 테스트한 모든 그룹(왼쪽 위 사분면)에서 약간의 괴사 세포가 관찰되었으며, 이는 세포자멸사가 RuDA 및 RuDA-NP에 의해 유도된 세포 사멸의 주된 형태일 수 있음을 시사합니다.
산화 스트레스 손상은 세포 사멸의 주요 결정 요인이기 때문에 항산화 시스템의 핵심 조절자인 적혈구 2, 인자 2(Nrf2) 62와 관련된 핵 인자가 RuDA-NP로 처리된 MDA-MB-231에서 조사되었습니다.조사에 의해 유도된 RuDA 나노입자의 작용 메커니즘.동시에, 다운스트림 단백질 헴 옥시게나제 1(HO-1)의 발현도 검출되었다.그림 6F 및 보충 그림 29에서 볼 수 있듯이 RuDA-NP 매개 광선 요법은 PBS 그룹과 비교하여 Nrf2 및 HO-1 발현 수준을 증가시켜 RuDA-NP가 산화 스트레스 신호 전달 경로를 자극할 수 있음을 나타냅니다.또한, RuDA-NPs63의 광열 효과를 연구하기 위해 열충격 단백질 Hsp70의 발현도 평가하였다.RuDA-NPs + 808 nm 레이저 조사로 처리된 세포가 다른 두 그룹에 비해 Hsp70의 증가된 발현을 보인 것은 분명하며, 이는 고열에 대한 세포 반응을 반영합니다.
놀라운 시험관 내 결과로 인해 MDA-MB-231 종양이 있는 누드 마우스에서 RuDA-NP의 생체 내 성능을 조사하게 되었습니다.RuDA NP의 조직 분포는 간, 심장, 비장, 신장, 폐 및 종양에서 루테늄 함량을 결정하여 연구되었습니다.그림과 같이.도 7a에 도시된 바와 같이, 정상 기관에서 광석 나노입자의 최대 함량은 최초 관찰 시간(4시간)에 나타났지만, 최대 함량은 주사 후 8시간에 종양 조직에서 결정되었으며, 이는 아마도 광석 나노입자 때문일 수 있다.LF의 EPR 효과.분포 결과에 따르면 NP 광석의 최적 처리 기간은 투여 후 8시간으로 나타났다.종양 부위에서 RuDA-NP가 축적되는 과정을 설명하기 위해 RuDA-NP의 광음향(PA) 특성은 주사 후 다른 시간에 RuDA-NP의 PA 신호를 기록하여 모니터링했습니다.먼저, RuDA-NP의 종양내 주사 후 종양 부위의 PA 이미지를 기록함으로써 생체내 RuDA-NP의 PA 신호를 평가하였다.보충 그림 30에서 볼 수 있듯이 RuDA-NP는 강한 PA 신호를 보였고 RuDA-NP 농도와 PA 신호 강도 사이에는 양의 상관 관계가 있었습니다(보충 그림 30A).그런 다음, 종양 부위의 생체 내 PA 이미지는 주사 후 다른 시점에서 RuDA 및 RuDA-NP의 정맥 주사 후 기록되었습니다.도 7B에 도시된 바와 같이, 종양 부위로부터의 RuDA-NPs의 PA 신호는 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하고 ICP-MS 분석에 의해 결정된 조직 분포 결과와 일치하는 주입 후 8시간에 안정기에 도달하였다.RuDA(보충 그림 30B)와 관련하여 최대 PA 신호 강도는 주사 후 4시간에 나타났으며, 이는 RuDA가 종양으로 빠르게 진입하는 속도를 나타냅니다.또한 ICP-MS를 이용하여 소변과 대변의 루테늄 양을 측정하여 RuDA와 RuDA-NPs의 배설 거동을 조사하였다.RuDA(보충 그림 31) 및 RuDA-NPs(그림 7C)의 주요 제거 경로는 대변을 통한 것이며 RuDA 및 RuDA-NPs의 효과적인 제거가 8일 연구 기간 동안 관찰되었으므로 RuDA가 RuDA-NP는 장기적인 독성 없이 체내에서 효율적으로 제거될 수 있습니다.
A. 마우스 조직에서 RuDA-NP의 생체외 분포는 주사 후 다양한 시간에 Ru 함량(조직 그램당 Ru(ID)의 투여량의 백분율)에 의해 결정되었습니다.데이터는 평균 ± 표준 편차입니다(n = 3). 쌍을 이루지 않은 양측 t 검정 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001. 쌍을 이루지 않은 양측 t 검정 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001.다른 시점에서 RuDA-NPs(10 µmol kg-1)의 정맥내 투여 후 808 nm 여기에서의 생체 내 종양 부위의 B PA 이미지.RuDA NPs(10 µmol kg-1)의 정맥 투여 후, C Ru는 다른 시간 간격으로 소변과 대변과 함께 쥐에서 배설되었습니다.데이터는 평균 ± 표준 편차입니다(n = 3).
생체 내 RuDA-NP의 가열 능력은 비교를 위해 MDA-MB-231 및 RuDA 종양이 있는 누드 마우스에서 연구되었습니다.그림과 같이.도 8a 및 보충 도 32에서, 대조군(식염수) 그룹은 연속 노출 10분 후 온도 변화(ΔT ≈ 3 °C)가 더 적었다.그러나 RuDA-NPs와 RuDA의 온도는 각각 55.2°C와 49.9°C의 최고 온도로 급격히 증가하여 생체 내 암 치료에 충분한 온열을 제공했습니다.RuDA(ΔT ≈ 19°C)에 비해 RuDA NP(ΔT ≈ 24°C)의 고온에서 관찰된 증가는 EPR 효과로 인한 종양 조직의 더 나은 투과성 및 축적 때문일 수 있습니다.
주사 후 8시간에 다른 시간에 808 nm 레이저로 조사된 MDA-MB-231 종양이 있는 마우스의 적외선 열 이미지.각 그룹의 4가지 생물학적 반복의 대표적인 이미지가 표시됩니다.B 상대적 종양 부피 및 C 치료 중 다양한 마우스 그룹의 평균 종양 질량.D 쥐의 다른 그룹의 체중 곡선.808 nm 파장의 레이저를 0.5 W/cm2의 출력으로 10분 동안 조사합니다(300 J/cm2).오차 막대, 평균 ± 표준 편차(n = 3). 쌍을 이루지 않은 양측 t 검정 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001. 쌍을 이루지 않은 양측 t 검정 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정 *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001. E H&E 염색 이미지는 식염수, 식염수 + 레이저, RuDA, RuDA + 레이저, RuDA-NP 및 RuDA-NPs + 레이저 그룹을 포함한 다양한 치료 그룹의 주요 장기 및 종양입니다. E H&E 염색 이미지는 식염수, 식염수 + 레이저, RuDA, RuDA + 레이저, RuDA-NP 및 RuDA-NPs + 레이저 그룹을 포함한 다양한 치료 그룹의 주요 장기 및 종양입니다. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E 염수, 염수 + 레이저, RuDA, RuDA + 레이저, RuDA-NPs 및 RuDA-NPs + 레이저 그룹을 포함한 다양한 치료 그룹의 주요 장기 및 종양의 H&E 염색 이미지.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 激光、RuDA、RuDA + 激光 和RuDA-NPs NPs 和RuDA-来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E 염수, 염수 + 레이저, RuDA, RuDA + 레이저, RuDA-NPs, RuDA-NPs + 레이저를 포함한 다양한 치료 그룹의 주요 장기 및 종양의 H&E 염색.스케일 바: 60 μm.
RuDA 및 RuDA 나노입자를 이용한 생체 내 광선요법의 효과는 MDA-MB-231 종양이 있는 알몸 마우스에 꼬리 정맥을 통해 10.0 µmol kg-1의 단일 용량으로 RuDA 또는 RuDA 나노입자를 정맥 주사한 다음 8 주사 후 몇 시간.808 nm의 파장으로 레이저 조사.도 8B에 도시된 바와 같이, 종양 부피는 염수 및 레이저 그룹에서 유의하게 증가하여 염수 또는 레이저 808 조사가 종양 성장에 거의 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다.식염수 그룹과 마찬가지로 레이저 조사 없이 RuDA-NPs 또는 RuDA를 처리한 마우스에서도 빠른 종양 성장이 관찰되어 낮은 암독성을 보여줍니다.대조적으로, 레이저 조사 후, RuDA-NP 및 RuDA 처리는 생리 식염수 처리군에 비해 각각 95.2% 및 84.3%의 종양 부피 감소로 유의한 종양 퇴행을 유도하여 우수한 상승적 PDT를 나타냅니다., RuDA/CHTV 효과에 의해 매개됩니다.– NP 또는 광석 RuDA와 비교하여 RuDA NP는 주로 RuDA NP의 EPR 효과에 기인한 더 나은 광치료 효과를 보였다.종양 성장 억제 결과는 치료 15일째에 절제된 종양 무게에 의해 추가로 평가되었습니다(그림 8C 및 보충 그림 33).RuDA-NP 처리 마우스와 RuDA 처리 마우스의 평균 종양 질량은 각각 0.08 및 0.27g으로 대조군(1.43g)보다 훨씬 가벼웠습니다.
또한, 생체 내에서 RuDA-NP 또는 RuDA의 암독성을 연구하기 위해 3일마다 마우스의 체중을 기록하였다.도 8D에 도시된 바와 같이, 체중의 유의한 차이는 모든 처리군에서 관찰되지 않았다. 또한, 다른 치료 그룹에서 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색이 수행되었습니다. 또한, 다른 처리 그룹에서 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행했습니다. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. 또한, 다른 처리 그룹의 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행했습니다.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红 (H&E) 染色。 (그) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. 또한 주요 장기(심장, 간, 비장, 폐 및 신장)의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 다른 처리군에서 수행했습니다.도 1에 도시된 바와 같이.도 8E에 도시된 바와 같이, RuDA-NP 및 RuDA 그룹의 5개 주요 기관의 H&E 염색 이미지는 명백한 이상 또는 기관 손상을 나타내지 않는다. 도 8E에 도시된 바와 같이, RuDA-NP 및 RuDA 그룹의 5개 주요 기관의 H&E 염색 이미지는 명백한 이상 또는 기관 손상을 나타내지 않는다.그림과 같이.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDAорне демонстрируют явных 8E, RuDA-NP 및 RuDA 그룹의 5개 주요 기관의 H&E 염색 이미지는 명백한 기관 이상 또는 병변을 나타내지 않습니다.如图8E 所示, 来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E如图8E 所示, 来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs м и RuDA 그림 8E와 같이 RuDA-NP 및 RuDA 그룹의 5개 주요 장기의 H&E 염색 이미지는 명백한 이상이나 장기 손상을 나타내지 않았습니다.이러한 결과는 RuDA-NP와 RuDA 모두 생체 내에서 독성 징후를 나타내지 않음을 보여주었다. 또한, 종양의 H&E 염색 이미지는 RuDA + Laser 및 RuDA-NPs + Laser 그룹 모두가 심각한 암세포 파괴를 일으킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 RuDA 및 RuDA-NPs의 우수한 생체내 광치료 효능을 입증했습니다. 또한, 종양의 H&E 염색 이미지는 RuDA + Laser 및 RuDA-NPs + Laser 그룹 모두가 심각한 암세포 파괴를 일으킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 RuDA 및 RuDA-NPs의 우수한 생체내 광치료 효능을 입증했습니다.또한, 헤마톡실린-에오신 염색 종양 이미지는 RuDA+Laser 및 RuDA-NPs+Laser 그룹이 모두 암세포의 심각한 파괴를 유도할 수 있음을 보여주었으며, 이는 생체 내에서 RuDA 및 RuDA-NPs의 우수한 광치료 효능을 입증했습니다.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Laser 和RuDA-NPs + Laser此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 。 癌细胞 。 破坏 ， 证明 了 ud-ruda 和。。。또한, 헤마톡실린 및 에오신 염색 종양 이미지는 RuDA+Laser 및 RuDA-NPs+Laser 그룹이 모두 암세포의 심각한 파괴를 초래하여 생체 내에서 RuDA 및 RuDA-NPs의 우수한 광치료 효능을 입증함을 보여주었습니다.
결론적으로, DA형 리간드를 갖는 Ru(II)-아렌(RuDA) 유기금속 착물은 응집법을 사용하여 ISC 공정을 용이하게 하도록 설계되었다.합성된 RuDA는 비공유 상호작용을 통해 자가 조립되어 RuDA 유래 초분자 시스템을 형성하여 1O2 형성을 촉진하고 광유도 암 치료를 위한 효율적인 광열 전환을 촉진합니다.단량체 RuDA는 808 nm의 레이저 조사에서 1O2를 생성하지 않았지만 응집된 상태에서 다량의 1O2를 생성할 수 있어 설계의 합리성과 효율성을 입증한다는 점은 주목할 만합니다.후속 연구에 따르면 초분자 어셈블리는 PDT 및 PTT 처리에 매우 바람직한 적색편이 흡수 및 광표백 저항성과 같은 개선된 광물리 및 광화학적 특성을 RuDA에 부여합니다.시험관 내 및 생체 내 실험 모두에서 생체 적합성이 좋고 종양에 축적이 잘 되는 RuDA 나노입자가 808 nm의 파장에서 레이저 조사 시 우수한 광 유도 항암 활성을 나타내는 것으로 나타났습니다.따라서 효과적인 바이모달 초분자 PDT/PTW 시약으로서 RuDA NP는 800 nm 이상의 파장에서 활성화된 감광제 세트를 풍부하게 할 것입니다.초분자 시스템의 개념 설계는 우수한 감광 효과와 함께 NIR 활성화 감광제에 대한 효율적인 경로를 제공합니다.
모든 화학 물질과 용매는 상업적 공급업체로부터 얻었고 추가 정제 없이 사용되었습니다.RuCl3는 Boren Precious Metal Co., Ltd.(Kunming, China)에서 구입했습니다.[(η6-p-cym)Ru(펜디오)Cl]Cl(펜디오 = 1,10-페난트롤린-5,6-디온) 및 4,7-비스[4-(N,N-디페닐아미노)페닐]-5 ,6-디아미노-2,1,3-벤조티아디아졸은 이전 연구64,65에 따라 합성되었습니다.NMR 스펙트럼은 d6-DMSO 또는 CDCl3를 용매로 사용하여 Southeastern University Analytical Test Center의 Bruker Avance III-HD 600MHz 분광계에서 기록되었습니다.화학적 이동 δ는 ppm으로 표시됩니다.테트라메틸실란과 관련하여 상호작용 상수 J는 헤르츠 단위의 절대값으로 제공됩니다.고분해능 질량분석기(HRMS)는 Agilent 6224 ESI/TOF MS 기기에서 수행되었습니다.C, H 및 N의 원소 분석은 Vario MICROCHNOS 원소 분석기(Elementar)에서 수행되었습니다.UV-가시광선 스펙트럼은 Shimadzu UV3600 분광광도계에서 측정되었습니다.형광 스펙트럼은 Shimadzu RF-6000 분광형광계에서 기록되었습니다.EPR 스펙트럼은 Bruker EMXmicro-6/1 기기에서 기록되었습니다.준비된 샘플의 형태와 구조는 200kV의 전압에서 작동하는 FEI Tecnai G20(TEM) 및 Bruker Icon(AFM) 기기에서 연구되었습니다.Nanobrook Omni 분석기(Brookhaven)에서 동적 광산란(DLS)을 수행했습니다.광전기화학적 특성은 전기화학적 설정(CHI-660, 중국)에서 측정하였다.FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR 시스템을 사용하여 광음향 이미지를 얻었습니다.Olympus FV3000 공초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 얻었습니다.FACS 분석은 BD Calibur 유세포 분석기에서 수행되었습니다.고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 실험은 2489 UV/Vis 검출기를 사용하여 Waters Alliance e2695 시스템에서 수행되었습니다.겔 투과 크로마토그래피(GPC) 테스트는 ERC RefratoMax520 굴절률 검출기를 사용하여 Thermo ULTIMATE 3000 기기에서 기록되었습니다.
[(η6-p-cym)Ru(펜디오)Cl]Cl(펜디오 = 1,10-페난트롤린-5,6-디온)64(481.0 mg, 1.0 mmol), 4,7-비스[4-(N, N-디페닐아미노)페닐]-5,6-디아미노-2,1,3-벤조티아디아졸 65(652.0 mg, 1.0 mmol) 및 빙초산(30 mL)을 환류 냉장고에서 12시간 동안 교반하였다.이어서, 회전 증발기를 사용하여 용매를 진공에서 제거하였다.얻어진 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, CH2Cl2:MeOH=20:1)로 정제하여 녹색 분말의 RuDA를 얻었다(수율: 877.5 mg, 80%).항문.C64H48Cl2N8RuS에 대해 계산: C 67.84, H 4.27, N 9.89.실측치: C 67.92, H 4.26, N 9.82.1H NMR(600MHz, d6-DMSO) δ 10.04(s, 2H), 8.98(s, 2H), 8.15(s, 2H), 7.79(s, 4H), 7.44(s, 8H), 7.21(d, J = 31.2Hz, 16H), 6.47(초, 2H), 6.24(초, 2H), 2.69(초, 1H), 2.25(초, 3H), 0.99(초, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 12.49, 4.94, 4.45, 120.89. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097.25.
4,7-비스[4-(N,N-디에틸아미노)페닐-5,6-디아미노-2,1,3-벤조티아디아졸(L2)의 합성: L2는 두 단계로 합성되었다.N,N-디에틸-4-(트리부틸스탄닐)아닐린(1.05g, 2.4mmol) 및 4,7-디브로모-5,6-디니트로 용액-2에 Pd(PPh3)4(46mg, 0.040mmol)를 첨가하고, 건조 톨루엔(100ml) 중 1,3-벤조티아디아졸(0.38g, 1.0mmol).혼합물을 100℃에서 24시간 동안 교반하였다.진공에서 톨루엔을 제거한 후, 생성된 고체를 석유 에테르로 세척하였다.이어서, 아세트산(20ml) 중의 이 화합물(234.0mg, 0.45mmol) 및 철 분말(0.30g, 5.4mmol)의 혼합물을 80℃에서 4시간 동안 교반하였다.반응 혼합물을 물에 붓고 생성된 갈색 고체를 여과에 의해 수집하였다.생성물을 진공 승화에 의해 2회 정제하여 녹색 고체를 얻었다(126.2 mg, 57% 수율).항문.C26H32N6S에 대해 계산: C 67.79, H 7.00, N 18.24.실측치: C 67.84, H 6.95, H 18.16.1H NMR(600MHz, CDCl3), δ(ppm) 7.42(d, 4H), 6.84(d, 4H), 4.09(s, 4H), 3.42(d, 8H), 1.22(s, 12H).13C NMR(150MHz, CDCl3), δ(ppm) 151.77, 147.39, 138.07, 131.20, 121.09, 113.84, 111.90, 44.34, 12.77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461.24.
화합물은 RuDA와 유사한 절차에 따라 제조 및 정제되었습니다.항문.C48H48Cl2N8RuS에 대해 계산: C 61.27, H 5.14, N 11.91.실측치: C, 61.32, H, 5.12, N, 11.81,1H NMR(600MHz, d6-DMSO), δ(ppm) 10.19(s, 2H), 9.28(s, 2H), 8.09(s, 2H), 7.95(s, 4H), 6.93(s, 4H), 6.48(d, 2H), 6.34(s, 2H), 3.54(t, 8H), 2.80(m, 1H), 2.33(s, 3H), 1.31 (t, 12H), 1.07(s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), δ (PPM) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 10.23, 104.23., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905.24.
RuDA는 10μM의 농도로 MeOH/H2O(5/95, v/v)에 용해되었습니다.RuDA의 흡수 스펙트럼은 808 nm(0.5 W/cm2) 파장의 레이저 광 조사 하에 Shimadzu UV-3600 분광 광도계에서 5분마다 측정되었습니다.ICG 스펙트럼은 표준과 동일한 조건에서 기록되었습니다.
EPR 스펙트럼은 20mW의 마이크로파 전력, 100G의 스캐닝 범위 및 1G의 필드 변조로 Bruker EMXmicro-6/1 분광계에서 기록되었습니다. 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidone (TEMP) 및 5,5-디메틸-1-피롤린 N-옥사이드(DMPO)를 스핀 트랩으로 사용하였다.전자 스핀 공명 스펙트럼은 파장 808nm(0.5W/cm2)의 레이저 방사선 작용 하에 RuDA(50μM)와 TEMF(20mM) 또는 DMPO(20mM)의 혼합 용액에 대해 기록되었습니다.
RuDA에 대한 DFT 및 TD-DFT 계산은 가우스 프로그램 1666,67,68을 사용하여 수용액에서 PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ 수준에서 수행되었습니다.저에너지 단일항 여기 상태 RuDA의 HOMO-LUMO, 정공 및 전자 분포는 GaussView 프로그램(버전 5.0)을 사용하여 플롯되었습니다.
우리는 먼저 ICG(ΦΔ = 0.002)를 표준으로 하는 기존의 UV-가시광선 분광법을 사용하여 1O2 RuDA의 생성 효율을 측정하려고 시도했지만 ICG의 광분해가 결과에 큰 영향을 미쳤습니다.따라서, 1O2 RuDA의 양자 수율은 808 nm(0.5 W/cm2)의 레이저를 조사했을 때 약 428 nm에서 ABDA 형광 강도의 변화를 감지하여 측정하였다.실험은 ABDA(50μM)를 포함하는 물/DMF(98/2, v/v)에서 RuDA 및 RuDA NP(20μM)에 대해 수행되었습니다.1O2의 양자 수율은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다. ΦΔ(PS) = ΦΔ(ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS와 rICG는 각각 감광제와 ICG에서 얻은 1O2에 대한 ABDA의 반응 속도입니다.APS와 AICG는 각각 808nm에서 감광제와 ICG의 흡광도입니다.
AFM 측정은 Bruker Dimension Icon AFM 시스템의 스캔 모드를 사용하여 액체 조건에서 수행되었습니다.액체 세포가 있는 개방형 구조를 사용하여 세포를 에탄올로 두 번 세척하고 질소 기류로 건조했습니다.현미경의 광학 헤드에 건조된 세포를 삽입합니다.즉시 샘플 한 방울을 액체 풀에 넣고 멸균 일회용 플라스틱 주사기와 멸균 바늘을 사용하여 캔틸레버에 놓습니다.다른 한 방울을 샘플 위에 직접 놓고 광학 헤드를 낮추면 두 방울이 합쳐져 샘플과 액체 저장소 사이에 메니스커스가 형성됩니다.AFM 측정은 SCANASYST-FLUID V형 질화물 캔틸레버(Bruker, 경도 k = 0.7 N m-1, f0 = 120–180 kHz)를 사용하여 수행되었습니다.
2489 UV/Vis 검출기를 사용하여 phoenix C18 컬럼(250 x 4.6 mm, 5 μm)이 장착된 Waters e2695 시스템에서 HPLC 크로마토그램을 얻었다.검출기의 파장은 650 nm입니다.이동상 A와 B는 각각 물과 메탄올이었고, 이동상 유속은 1.0 ml·min-1이었다.구배(용매 B)는 다음과 같았다: 0에서 4분까지 100%, 5분에서 30분까지 100%에서 50%, 31분에서 40분까지 100%로 재설정.광석은 50 μM의 농도로 메탄올과 물의 혼합 용액(50/50, 부피비)에 용해되었다.주입 부피는 20㎕였다.
GPC 분석은 2개의 PL aquagel-OH MIXED-H 컬럼(2 x 300 x 7.5 mm, 8 µm)과 ERC RefratoMax520 굴절률 검출기가 장착된 Thermo ULTIMATE 3000 기기에서 기록되었습니다.GPC 컬럼은 30℃에서 1 ml/min의 유속으로 물로 용리되었다.광석 NP는 PBS 용액(pH = 7.4, 50μM)에 용해되었고 주입 부피는 20μL였습니다.
광전류는 전기화학적 설정(CHI-660B, 중국)에서 측정되었습니다.레이저를 켰을 때와 껐을 때(808 nm, 0.5 W/cm2) 광전자 응답은 각각 0.5 V의 전압에서 블랙 박스에서 측정되었습니다.표준 3전극 전지는 L자형 유리 탄소 전극(GCE)을 작업 전극으로, 표준 칼로멜 전극(SCE)을 기준 전극으로, 백금 디스크를 상대 전극으로 사용했습니다.0.1M Na2SO4용액을 전해질로 사용하였다.
인간 유방암 세포주 MDA-MB-231은 KeyGEN Biotec Co., LTD(중국 난징, 카탈로그 번호: KG033)에서 구입했습니다.세포는 10% 소태아혈청(FBS), 페니실린(100㎍/ml) 및 스트렙토마이신(100㎍/ml)의 용액이 보충된 둘베코 변형 독수리 배지(DMEM, 고글루코스)에서 단층으로 성장시켰다.모든 세포는 5% CO2를 포함하는 습한 대기에서 37°C에서 배양되었습니다.
MTT 분석은 Vc(0.5mM)의 유무에 관계없이 빛 조사의 존재 및 부재 하에 RuDA 및 RuDA-NP의 세포독성을 결정하는 데 사용되었습니다.MDA-MB-231 암세포를 96웰 플레이트에서 대략 1 x 105 cells/ml/well의 세포 밀도로 성장시키고 5% CO2 및 95% 공기의 분위기에서 37.0°C에서 12시간 동안 인큐베이션했습니다.물에 용해된 RuDA 및 RuDA NP를 세포에 첨가하였다.12시간의 인큐베이션 후, 세포를 808 nm의 파장에서 0.5 W cm -2 레이저 방사선에 10분(300 J cm -2) 동안 노출시킨 다음, 24시간 동안 암소에서 인큐베이션하였다.이어서, 세포를 MTT(5 mg/ml)와 함께 추가 5시간 동안 인큐베이션하였다.마지막으로, 결과 보라색 포르마잔 결정을 용해하기 위해 DMSO(200 μl)로 배지를 변경합니다.OD 값은 파장이 570/630 nm인 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정되었습니다.각 샘플에 대한 IC50 값은 최소 3개의 독립적인 실험에서 얻은 용량-반응 곡선에서 SPSS 소프트웨어를 사용하여 계산되었습니다.
MDA-MB-231 세포를 50μM 농도의 RuDA 및 RuDA-NP로 처리하였다.12시간 배양 후, 세포에 파장 808nm, 출력 0.5W/cm2의 레이저를 10분간(300J/cm2) 조사하였다.비타민 C(Vc) 그룹에서 세포는 레이저 조사 전에 0.5mM Vc로 처리되었다.그런 다음 세포를 추가 24시간 동안 암실에서 인큐베이션한 다음 칼세인 AM 및 요오드화 프로피디움(20μg/ml, 5μl)으로 30분 동안 염색한 다음 PBS(10μl, pH 7.4)로 세척했습니다.염색된 세포의 이미지.