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활성화된 에스테르 또는 페녹시 라디칼을 기반으로 하는 효소적 근접 라벨링 방법은 살아있는 세포에서 세포내 프로테옴 및 단백질 상호작용자를 매핑하는 데 널리 사용됩니다.그러나 활성화된 에스테르는 반응성이 낮아 넓은 표지 반경을 가져오고 과산화물 처리에 의해 생성된 페녹시 라디칼은 산화환원 경로를 방해할 수 있습니다.여기에서 우리는 miniSOG 감광제 단백질을 관심 있는 단백질에 유전적으로 연결하여 개발된 근접 라벨링 종속 광활성화(PDPL) 방법을 보고합니다.청색광에 의해 트리거되고 노출 시간에 의해 제어되는 일중항 산소가 생성된 다음 아닐린 프로브에 의해 시공간적으로 분해된 히스티딘 잔기의 라벨링이 달성됩니다.우리는 세포 소기관 특정 프로테옴 매핑을 통해 높은 충실도를 보여줍니다.PDPL과 TurboID를 나란히 비교하면 PDPL에 대한 보다 구체적이고 포괄적인 단백질 범위가 표시됩니다.다음으로, 우리는 PDPL을 질병 관련 전사 보조 활성화제 BRD4 및 E3 Parkin ligase에 적용하고 이전에 알려지지 않은 상호 작용자를 찾았습니다.과발현 스크리닝을 통해 Ssu72 및 SNW1이라는 두 가지 미지의 기질이 유비퀴틴화-프로테아좀 경로에 의해 매개되는 파킨에 대해 확인되었습니다.
단백질 네트워크의 정확한 특성화는 많은 기본적인 세포 과정의 기초가 됩니다.따라서 단백질 상호 작용의 매우 정확한 시공간 매핑은 생물학적 경로, 질병 병리를 해독하고 치료 목적으로 이러한 상호 작용을 방해하기 위한 분자 기반을 제공합니다.이를 위해, 살아있는 세포 또는 조직에서 시간적 상호작용을 검출할 수 있는 방법이 매우 바람직하다.Affinity Purification Mass Spectrometry(AP-MS)는 역사적으로 관심 단백질(POI)의 결합 파트너를 식별하는 데 사용되었습니다.정량적 proteomics 방법의 발달로 AP-MS 기반의 최대 단백질 네트워크 데이터베이스인 Bioplex3.0이 만들어졌습니다.AP-MS는 매우 강력하지만 워크플로의 세포 용해 및 희석 단계는 약하고 일시적인 결합 상호 작용으로 편향되어 있으며 용해 전에 구획화가 부족한 가짜 상호 작용 쌍과 같은 용해 후 아티팩트를 도입합니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 가교 그룹이 있는 비천연 아미노산(UAA)과 효소적 근거리 표지(PL) 플랫폼(예: APEX 및 BioID)5이 개발되었습니다.UAA 방법은 많은 시나리오에서 성공적으로 적용되었으며 직접 단백질 접착제에 대한 정보를 제공하지만 UAA 삽입 부위의 최적화는 여전히 필요합니다.더 중요한 것은 라벨링 이벤트의 촉매적 반전이 없는 화학량론적 라벨링 방법입니다.대조적으로, BioID 방법과 같은 효소적 PL 방법은 조작된 비오틴 리가아제를 POI7에 융합하고, 이는 후속적으로 비오틴을 활성화하여 반응성 비오틴-AMP 에스테르 중간체를 형성합니다.따라서 효소는 근위 라이신 잔기를 표시하는 활성화된 비오틴 "구름"을 촉매하고 방출합니다.그러나 BioID는 충분한 표지된 신호를 얻기 위해 12시간 이상이 필요하므로 시간적 분해능과 함께 사용할 수 없습니다.효모 디스플레이를 기반으로 한 유도 진화를 사용하여 TurboID는 BioID를 기반으로 더 효율적으로 설계되어 10분 이내에 비오틴으로 효율적으로 라벨링할 수 있어 보다 역동적인 프로세스를 연구할 수 있습니다.TurboID는 활성이 높고 내인성 비오틴 수준이 낮은 수준의 라벨링에 충분하기 때문에 배경 라벨링은 외인성 비오틴의 추가에 의해 고도로 강화되고 시기적절한 라벨링이 필요할 때 잠재적인 문제가 됩니다.또한, 활성화된 에스테르는 반응성이 낮기 때문에(t1/2 ~5분), 특히 인접 단백질을 비오틴 5로 포화시킨 후 큰 표지 반경을 유발할 수 있습니다. 페놀 라디칼을 제거하고 1분 이내에 단백질 라벨링 가능9,10. APEX는 세포내 프로테옴, 막 단백질 복합체 및 세포질 신호 전달 단백질 복합체를 식별하는 데 널리 사용됩니다. 세포 과정.
따라서, 세포 경로를 크게 방해하지 않으면서 높은 공간적 및 시간적 정확도로 더 반응성인 표지된 반경 억제 종을 생성할 수 있는 새로운 방법은 기존 방법에 중요한 추가 사항이 될 것입니다. 반응성 종 중에서 일중항 산소는 짧은 수명과 제한된 확산 반경(세포에서 t1/2 < 0.6 µs)으로 인해 우리의 관심을 불러일으켰습니다. 반응성 종 중에서 일중항 산소는 짧은 수명과 제한된 확산 반경(세포에서 t1/2 < 0.6 µs)으로 인해 우리의 관심을 불러일으켰습니다. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. 활성 형태 중에서 일중항 산소는 수명이 짧고 확산 반경이 제한되어 있기 때문에 우리의 관심을 끌었습니다(세포에서 t1/2 < 0.6 µs)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）而引起了我们3注 1/2 < 0.6 µs) 而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). 활성 형태 중에서 일중항 산소는 짧은 수명과 제한된 확산 반경(세포에서 t1/2 < 0.6μs)으로 인해 우리의 관심을 끌고 있습니다.일중항 산소는 메티오닌, 티로신, 히스티딘 및 트립토판을 무작위로 산화시켜 아민 또는 티올 기반 프로브에 부착하기 위해 극성 14,15로 만드는 것으로 보고되었습니다.일중항 산소가 세포내 구획 RNA를 라벨링하는 데 사용되었지만, 내인성 POI 근접 마커를 용도 변경하기 위한 전략은 미개척 상태로 남아 있습니다.여기에서 우리는 청색광을 사용하여 miniSOG 감광제와 융합된 POI를 조명하고 근위 잔류물을 산화시키기 위해 일중항 산소 생성을 유발한 다음 화학 프로브를 중간 살아있는 세포..태그 특이성을 최대화하기 위해 화학 프로브 그룹을 테스트하고 개방형 단백질체학 워크플로를 사용하여 수정 사이트를 식별했습니다.PDPL과 TurboID를 나란히 비교하면 PDPL에 대한 보다 구체적이고 포괄적인 단백질 범위가 표시됩니다.우리는 이 접근법을 세포내 프로테옴의 소기관 특이적 마커 및 암 관련 후성 유전 조절 단백질 BRD4 및 파킨슨병 관련 E3 리가제 파킨에 대한 결합 파트너의 일반적인 프로테옴 식별에 적용했으며, 이는 단백질의 알려진 네트워크와 알려지지 않은 네트워크를 모두 확인했습니다. 상호 작용..PDPL이 큰 단백질 복합체에서 E3 기질을 인식하는 능력은 간접 결합제의 인식이 필요한 상황을 나타냅니다.유비퀴틴화-프로테아좀에 의해 매개되는 두 가지 알려지지 않은 파킨 기질이 현장에서 확인되었습니다.
광과민제를 사용한 빛 조사가 일중항 산소를 생성하는 광역학 요법(PDT)19 및 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)20는 표적 단백질을 비활성화하거나 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.일중항 산소는 이론적인 확산 거리가 약 70 nm인 고 반응성 물질이기 때문에 감광제 주변의 공간적으로 제한된 산화를 제어할 수 있습니다.이 개념을 기반으로 우리는 단일항 산소를 사용하여 살아있는 세포에서 단백질 복합체의 긴밀한 표지를 달성하기로 결정했습니다.우리는 네 가지 기능을 수행하기 위해 PDPL 화학단백체학 접근법을 개발했습니다. (1) PL 효소 접근법과 유사한 활성 일중항 산소 생성을 촉매하기 위해(2) 광 개시 시 시간 분해 라벨링을 제공합니다.(3) 변경에 의해 (4) 배경을 줄이기 위해 내인성 보조인자(예: 비오틴)를 사용하지 않거나 환경 스트레스에 대한 세포 노출을 최소화하기 위해 매우 교란하는 외인성 시약(예: 과산화물)을 사용합니다.
감광제는 저분자량 형광단(예: 로즈 벵갈, 메틸렌 블루)22과 유전적으로 암호화된 작은 단백질(예: miniSOG, KillerRed)23을 포함하는 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다.모듈식 설계를 달성하기 위해 우리는 POI24,25(그림 1a)에 감광제(PS) 단백질을 추가하여 1세대 PDPL 플랫폼을 개발했습니다.청색광을 조사하면 일중항 산소는 근위 친핵성 아미노산 잔기를 산화시켜 친전자성인 음극 극성을 생성하고 아민 프로브 친핵체와 추가로 반응할 수 있습니다.프로브는 LC/MS/MS 특성화를 위해 클릭 화학 및 풀다운이 가능하도록 알킨 핸들로 설계되었습니다.
miniSOG에 의해 매개되는 단백질 복합체의 라벨링에 대한 개략도.청색광에 노출되면 miniSOG-POI를 발현하는 세포는 단일항 산소를 생성하여 상호 작용하는 단백질을 수정하지만 비결합 단백질은 수정하지 않습니다.광산화의 중간 생성물은 아민 화학 프로브의 릴레이 라벨에 의해 차단되어 공유 부가물을 형성합니다.화학 프로브의 알키닐 그룹은 풀다운에 이어 LC-MS/MS 정량에 의한 농축을 위한 클릭 화학을 허용합니다.b 아민 프로브의 화학 구조 1-4.c 프로브 1-4를 사용한 미토콘드리아 국부적 miniSOG 매개 단백질체 마커의 대표적인 형광 겔 분석 및 겔 농도계에 기반한 상대 정량화.화학적 프로브의 신호 대 배경 비율은 청색광을 제외한 음성 대조군 실험을 사용하거나 miniSOG 발현이 없는 HEK293T 세포를 사용하여 평가되었습니다.n = 2개의 생물학적으로 독립적인 샘플.각 점은 생물학적 복제본을 나타냅니다.d 다음과 같이 표시된 PDPL 구성 요소의 존재 또는 부재에서 최적화된 프로브 3을 사용한 PDPL의 대표적인 검출 및 정량화.n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플.각 점은 생물학적 복제본을 나타냅니다.중심선과 수염은 평균과 ± 표준 편차를 나타냅니다.CBB: 쿠마시 브릴리언트 블루.e 원적외선 Si-DMA 염색을 사용한 일중항 산소의 공초점 이미징.스케일 바: 10 μm.젤 이미징 및 공초점 실험은 유사한 결과로 최소 두 번 독립적으로 반복되었습니다.
우리는 먼저 HEK293T에서 안정적으로 발현되는 성숙한 감광제 miniSOG26 및 KillerRed23이 프로테옴의 프로파길아민 표지를 화학적 프로브로 매개하는 능력을 테스트했습니다(보충 그림 1a).겔 형광 분석은 miniSOG 및 청색광 조사를 사용하여 전체 프로테옴 라벨링이 달성된 반면, KillerRed에서는 가시적 라벨링 제품이 관찰되지 않음을 보여주었습니다.신호 대 배경 비율을 개선하기 위해 아닐린(1 및 3), 프로필아민(2) 또는 벤질아민(4)을 포함하는 화학 프로브 세트를 테스트했습니다.우리는 HEK293T 세포 자체가 청색광이 없는 경우에 비해 배경 신호가 더 높다는 것을 관찰했는데, 이는 아마도 내인성 리보플라빈 감광제인 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN) 27 때문일 수 있습니다. 아닐린 기반 화학 프로브 1 및 3은 미토콘드리아에서 miniSOG를 안정적으로 발현하는 HEK293T가 프로브 3에 대한 신호의 >8배 증가를 나타내는 반면 RNA-표지 방법 CAP-seq에 사용된 프로브 2는 ~2.5-만을 표시하여 더 나은 특이성을 제공했습니다. RNA와 단백질 사이의 반응성 선호도가 다르기 때문에 fold 신호 증가가 있을 수 있습니다(그림 1b, c). 아닐린 기반 화학 프로브 1 및 3은 미토콘드리아에서 miniSOG를 안정적으로 발현하는 HEK293T가 프로브 3에 대한 신호의 >8배 증가를 나타내는 반면 RNA-표지 방법 CAP-seq에 사용된 프로브 2는 ~2.5-만을 표시하여 더 나은 특이성을 제공했습니다. RNA와 단백질 사이의 반응성 선호도가 다르기 때문에 fold 신호 증가가 있을 수 있습니다(그림 1b, c).Aniline 기반의 화학 프로브 1과 3이 더 나은 특이성을 나타냄: 미토콘드리아에서 miniSOG를 안정적으로 발현하는 HEK293T는 프로브 3에 대한 신호가 8배 이상 증가한 반면, CAP-seq RNA 라벨링 방법에 사용되는 프로브 2는 단지 아마도 RNA와 단백질 사이의 반응성 선호도가 다르기 때문에 ~2.5배 신호 증가를 보여줍니다(그림 1b, c).基于 基于 基于 的 苯胺 探针 1 和 3 和 3 具有 更 更 好 的 的 特异性 特异性 特异性 特异性, Hek293t 在 线 线 粒体 中 稳定 稳定 表达 表达 表达 미니 모그, 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 倍 倍 用 于 于 于 标记 标记 方法 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ ~. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。CAP-EQ 的 2 仅 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 - 倍信号增加，可能是由于RNA아닐린 기반의 화학 프로브 1과 3은 특이성이 더 좋았고, HEK293T는 미토콘드리아에서 miniSOG를 안정적으로 발현했으며, 프로브 3은 신호가 8배 이상 증가한 반면, CAP-seq RNA 표지 방법에 대한 프로브 2는 ~2.5배 증가에 불과했습니다.신호에서 아마도 RNA와 단백질 사이의 반응 선호도가 다르기 때문일 것입니다(그림 1b, c).또한 프로브 3 이성질체와 히드라진 프로브(프로브 5, 6, 7)를 테스트하여 프로브 3의 최적화를 확인했습니다(보충 그림 1b,c).유사하게, 겔 내 형광 분석은 조사 파장(460nm), 화학 프로브 농도(1mM) 및 조사 시간(20분)과 같은 최적화된 다른 실험 매개변수를 보여주었습니다(보충 그림 2a-c).PDPL 프로토콜에서 구성 요소나 단계를 생략하면 배경에 대한 상당한 신호 반전이 발생했습니다(그림 1d).특히, 단백질 표지는 일중항 산소를 소멸시키는 것으로 알려진 아지드화나트륨 또는 트롤록스의 존재하에서 상당히 감소했습니다.일중항 산소를 안정화시키는 것으로 알려진 D2O의 존재는 표지 신호를 향상시킵니다.라벨링에 대한 다른 활성 산소 종의 기여도를 조사하기 위해 만니톨과 비타민 C를 첨가하여 각각 하이드록실 및 슈퍼옥사이드 라디칼 제거제를 확립했지만 18, 29, 라벨링을 감소시키는 것으로 밝혀지지 않았습니다.조명이 아닌 H2O2를 추가해도 레이블이 지정되지 않았습니다(보충 그림 3a).Si-DMA 프로브를 사용한 형광 단일항 산소 이미징은 HEK293T-miniSOG 와이어에 단일항 산소의 존재를 확인했지만 원래 HEK293T 와이어에는 존재하지 않았습니다.또한 mitoSOX Red는 조명 후 슈퍼옥사이드 생성을 감지할 수 없었습니다(그림 1e 및 보충 그림 3b) 30. 이러한 데이터는 일중항 산소가 후속 단백질 라벨링을 담당하는 주요 활성 산소 종임을 강력하게 시사합니다.PDPL의 세포 독성은 청색광 조사 및 화학 프로브를 포함하여 평가되었으며 유의미한 세포 독성은 관찰되지 않았습니다(보충 그림 4a).
라벨링 메커니즘을 연구하고 LC-MS/MS를 사용하여 단백질 복합체의 단백질체 식별을 가능하게 하려면 먼저 수정된 아미노산과 프로브 라벨의 델타 질량을 결정해야 합니다.메티오닌, 히스티딘, 트립토판 및 티로신은 일중항 산소에 의해 변형되는 것으로 보고되었습니다.TOP-ABPP31 워크플로를 MSFragger32 기반 FragPipe 컴퓨팅 플랫폼에서 제공하는 편견 없는 공개 검색과 통합합니다.일중항 산소 변형 및 화학적 프로브 라벨링 후, 절단 가능한 링커를 포함하는 비오틴 환원 라벨을 사용하여 클릭 화학을 수행한 다음, 뉴트라비딘 스트레칭 및 트립신 소화를 수행했습니다.여전히 수지에 결합된 변형된 펩티드는 LC-MS/MS 분석을 위해 광절단되었습니다(그림 2a 및 보충 데이터 1).50개 이상의 펩타이드 맵(PSM) 일치 항목이 나열된 프로테옴 전체에 걸쳐 많은 수의 변형이 발생했습니다(그림 2b).놀랍게도, 우리는 아마도 다른 아미노산보다 아닐린 프로브에 대한 산화된 히스티딘의 더 높은 반응성으로 인해 히스티딘의 변형만을 관찰했습니다.일중항 산소에 의한 히스티딘 산화의 공개된 메커니즘에 따르면,21,33 제안된 +229 Da의 델타-질량 구조는 두 번의 산화 후 프로브 3과 2-옥소-히스티딘의 부가물에 해당하며, +247 Da는 가수분해 생성물입니다. +229 Da (보충 그림 5).MS2 스펙트럼의 평가는 변형된 조각 이온(y 및 b)의 식별을 포함하여 대부분의 y 및 b 이온 식별의 높은 신뢰성을 보여주었다(그림 2c).PDPL 수정 히스티딘의 국소 서열에 대한 컨텍스트 분석은 ±1 위치에서 작은 소수성 잔기에 대한 적당한 모티프 선호를 보여주었습니다(보충 그림 4b).평균적으로 단백질당 1.4개의 히스티딘이 확인되었으며 이러한 마커의 위치는 용매 접근 가능 표면적(SASA) 및 상대 용매 가용성(RSA) 분석에 의해 결정되었습니다(보충 그림 4c, d).
MSFragger에서 제공하는 FragPipe 컴퓨팅 플랫폼을 사용하여 잔류 선택성을 연구하기 위한 편견 없는 워크플로.절단 가능한 링커는 스트렙타비딘 수지로부터 변형된 펩티드의 광절단을 허용하기 위해 Click 화학에서 사용됩니다.관련 잔재뿐만 아니라 수많은 수정 사항을 식별하기 위해 공개 검색이 시작되었습니다.b 프로테옴 전체에서 발생하는 수정의 질량을 지정합니다.펩티드 매핑 PSM.c 프로브 3으로 변형된 히스티딘 부위의 MS2 스펙트럼 주석. 대표적인 예로서, 프로브 3과의 공유 반응은 변형된 아미노산에 +229.0938 Da를 추가했습니다.d PDPL 마커를 테스트하는 데 사용되는 돌연변이 분석.PRDX3(H155A, H225A) 및 PRDX1(H10A, H81A, H169A)을 항-Flag 검출을 위해 야생형 플라스미드로 형질감염시켰다.e 합성 펩타이드는 프로브 3의 존재 하에 정제된 miniSOG와 반응하였고, Δm +247 및 +229를 갖는 상응하는 생성물이 LC-MS 스펙트럼에 기록되었다.f miniSOG-6xHis 태그 및 항6xHis 항체로 모델링된 시험관 내 단백질 대 단백질 상호작용.빛에 노출된 시간에 따라 프로브 3으로 표지된 miniSOG-6xHis/anti-6xHis 항체 복합체의 Antibiotin(streptavidin-HRP) 및 anti-mouse Western blot 분석.개별 단백질에 대한 라벨은 해당 분자량으로 표시됩니다: LC 항체 경쇄, HC 항체 중쇄.이 실험은 유사한 결과로 최소 두 번 독립적으로 반복되었습니다.
표지 부위의 생화학적 검증을 위해, 질량분석법으로 확인된 PRDX3 및 PRDX1을 히스티딘에서 알라닌으로 변경하고 형질감염 분석에서 야생형과 비교하였다.PDPL 결과는 돌연변이가 표지를 유의하게 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 2d).한편, 공개 검색에서 확인된 펩티드 서열을 합성하고 프로브 3 및 청색광이 있는 상태에서 정제된 miniSOG와 시험관 내 반응시켜 LC-MS로 검출할 때 +247 및 +229 Da의 질량 이동을 갖는 생성물을 생성하였다(도 4a). 2e).).상호 작용하는 근위 단백질이 miniSOG 광활성화에 대한 반응으로 시험관 내에서 표지될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 우리는 시험관 내에서 miniSOG-6xHis 단백질과 항-His 단일 클론 항체 간의 상호 작용에 의한 인공 근접 분석을 설계했습니다(그림 2f).이 분석에서 우리는 miniSOG로 항체 중쇄 및 경쇄의 근위 표지를 예상했습니다.사실, 항-마우스(항-6xHis-표지된 항체의 중쇄 및 경쇄 인식) 및 스트렙타비딘 웨스턴 블롯은 중쇄 및 경쇄의 강한 비오틴화를 보여주었다.특히, 우리는 라이신과 2-옥소-히스티딘 근위 반응 사이의 이전에 설명된 간격과 관련될 수 있는 6xHis 태그 및 경쇄와 중쇄 사이의 가교로 인한 miniSOG 자가 바이오틴화를 확인했습니다.결론적으로, 우리는 PDPL이 근접 의존적 방식으로 히스티딘을 수정한다는 결론을 내립니다.
우리의 다음 목표는 세포 내 단백질체를 특성화하여 제자리 표지의 특이성을 테스트하는 것이 었습니다.따라서 우리는 HEK293T 세포의 핵, 미토콘드리아 기질 또는 외부 ER 막에서 miniSOG를 안정적으로 발현했습니다 (그림 3a).겔 형광 분석은 3개의 세포내 위치에서 풍부한 표지된 밴드와 다른 표지 패턴을 나타냈다(그림 3b).형광 영상 분석은 PDPL의 높은 특이성을 보였다(그림 3c).PDPL 워크플로우는 형광 현미경을 사용하여 세포내 프로테옴을 묘사하기 위해 로다민 염료를 사용한 클릭 반응으로 이어졌고 PDPL 신호는 DAPI, 미토콘드리아 추적기 또는 ER 추적기와 공동 국소화되어 PDPL의 높은 충실도를 확인했습니다.3개의 세포 소기관 위치에 대해, 아비딘 웨스턴 블롯을 사용하여 PDPL과 TurboID를 나란히 비교한 결과 PDPL이 각각의 대조군과 비교하여 더 구체적으로 표지되었음을 보여주었습니다.PDPL 조건에서 더 많은 표지된 밴드가 나타나 더 많은 PDPL 표지된 단백질을 나타냅니다(보충 그림 6a-d).
miniSOG 매개 소기관 특이적 프로테옴 라벨링의 도식적 표현.miniSOG는 인간 COX4(mito-miniSOG)의 N-말단 23개 아미노산에 대한 융합을 통해 미토콘드리아 기질을 표적으로 하고, H2B(nucleus-miniSOG)에 대한 융합을 통해 핵을, ER 막(ER-miniSOG)의 세포질 측을 통해 Sec61β를 표적으로 합니다. ).적응증에는 겔 이미징, 공초점 이미징 및 질량 분석이 포함됩니다.b 3가지 세포 소기관 특이적 PDPL 프로파일의 대표적인 겔 이미지.CBB 쿠마시 브릴리언트 블루.c V5(빨간색)로 표지된 항체에 의해 검출된 다양한 세포내 국소화로 miniSOG를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포의 대표적인 공초점 이미지.세포내 마커는 미토콘드리아 및 ER(녹색)에 사용됩니다.PDPL 워크플로우에는 Cy3-azide 클릭 화학을 사용하여 miniSOG(노란색) 표지된 세포내 프로테옴의 검출이 포함됩니다.스케일 바: 10 μm.d 표지되지 않은 정량화(n = 3개의 독립적인 생물학적 실험)에 의해 정량화된 다양한 소기관에서 PDPL 태그가 지정된 프로테옴의 화산 플롯.양측 스튜던트 t-검정은 화산 플롯에 사용되었습니다.HEK293T 야생형을 음성 대조군으로 사용하였다. 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 >2배 이온 강도 차이). 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 >2배 이온 강도 차이). 더 보기 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 >2배 이온 강도 차이).显着变化的蛋白质以红色突出显示(p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异)。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной). 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 > 2배 이온 강도 차이).HEK293T-miniSOG에는 중요하지만 HEK293T에는 중요하지 않은 관련 단백질은 녹색으로 표시됩니다.e 실험에서 얻은 proteomic 데이터 세트의 특이성 분석 d.각 소기관(빨간색 및 녹색 점)에서 통계적으로 유의한 총 단백질 수는 상단에 표시됩니다.히스토그램은 MitoCarta 3.0, GO 분석 및 A. Ting et al.사람들.미토콘드리아, 핵 및 ER에 대한 별도의 데이터 세트.이 실험은 유사한 결과로 최소 두 번 독립적으로 반복되었습니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일의 형태로 제공됩니다.
겔 및 이미징 결과에 힘입어 라벨 없는 정량화를 사용하여 각 소기관에서 식별된 프로테옴을 정량화했습니다(보충 데이터 2).형질감염되지 않은 HEK293T를 음성 대조군으로 사용하여 배경 마커를 뺍니다. 화산 플롯 분석은 상당히 풍부한 단백질(p < 0.05 및 >2배 이온 강도)과 miniSOG 발현 라인에만 존재하는 싱글톤 단백질을 표시했습니다(그림 3d 빨간색 및 녹색 점). 화산 플롯 분석은 상당히 풍부한 단백질(p < 0.05 및 >2배 이온 강도)과 miniSOG 발현 라인에만 존재하는 싱글톤 단백질을 표시했습니다(그림 3d 빨간색 및 녹색 점). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). 화산 플롯 분석은 상당히 풍부한 단백질(p<0.05 및 >2-배 이온 강도)과 miniSOG-발현 라인에만 존재하는 단일 단백질(그림 3d, 빨간색 및 녹색 점)을 보여주었습니다.火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). 화산 플롯 분석은 상당히 풍부한 단백질(p<0.05 및 >2x 이온 강도)과 miniSOG 발현 라인에만 존재하는 단일 단백질(그림 3d의 빨간색 및 녹색 점)을 보여주었습니다.이러한 데이터를 결합하여 통계적으로 유의한 핵, 미토콘드리아 및 ER 외막 단백질을 각각 1364개, 461개 및 911개 식별했습니다.소기관에 국한된 PDPL의 정확도를 분석하기 위해 MitoCarta 3.0, Gene Ontology(GO) 분석 및 A. Ting et al.73.4, 78.5 및 73.0%의 정확도에 해당하는 미토콘드리아, 핵 및 ER에 대해 데이터 세트8를 사용하여 검출된 단백질의 소기관 특이성을 테스트했습니다(그림 3e).PDPL의 특이성은 PDPL이 세포 소기관 특이적 프로테옴을 식별하기 위한 이상적인 도구임을 확인시켜줍니다.특히, 동정된 미토콘드리아 단백질에 대한 서브미토콘드리아 분석은 포획된 프로테옴이 기질과 내막(각각 226개 및 106개)에 주로 분포되어 확인된 미토콘드리아 단백질 총 수의 91.7%(362개)를 차지하는 것으로 나타났습니다.높은 수준의 PDPL이 추가로 확인되었습니다(보충 그림 7a).유사하게, 핵하 분석은 포획된 프로테옴이 핵, 핵질 및 핵소체에 주로 분포되어 있음을 보여주었다(보충 그림 7b).핵 국소화 신호 펩티드(3xNLS)를 사용한 핵 단백질체 분석은 H2B 구조와 유사한 정확도를 보여주었습니다(보충 그림 7c-h).PDPL 마커의 특이성을 결정하기 위해 핵 라미닌 A가 더 이산적으로 국한된 POI7 트랩으로 선택되었습니다.PDPL은 36개의 유의하게 농축된 단백질을 확인했으며, 그 중 12개의 단백질(라민 A를 포함하여 30.0%)은 String 데이터베이스에 의해 주석이 달린 잘 특성화된 라민 A 상호 작용 단백질이며 BioID 방법(122개의 단백질)보다 높은 비율로 28/28입니다. , 22.9 %) 7. 우리의 방법은 제한된 표지 영역으로 인해 더 적은 수의 단백질을 식별했으며, 이는 더 많은 활성 일중항 산소에 의해 가능했습니다.GO 분석을 통해 확인된 단백질은 주로 핵질(26), 핵막(10), 핵막(9) 및 핵공(5)에 위치하는 것으로 나타났습니다.종합적으로, 이러한 핵 국소 단백질은 농축 단백질의 80%를 차지하여 PDPL의 특이성을 추가로 보여줍니다(보충 그림 8a-d).
소기관에서 근접 마킹을 수행하는 PDPL의 능력을 확립한 후, 우리는 PDPL을 POI 결합 파트너를 분석하는 데 사용할 수 있는지 여부를 테스트했습니다.특히, 우리는 세포질 단백질의 PDPL 분석을 정의하고자 했으며, 이는 매우 역동적인 특성으로 인해 막에 국한된 대응물보다 더 어려운 표적으로 간주됩니다.bromodomain 및 extraterminal(BET) 단백질 BRD4는 다양한 질병 35, 36에서 핵심적인 역할로 우리의 관심을 끌고 있습니다.BRD4에 의해 형성된 복합체는 전사 보조 활성화제이자 중요한 치료 표적입니다.c-myc 및 Wnt5a 전사 인자의 발현을 조절함으로써 BRD4는 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종, 버킷 림프종, 결장암 및 염증성 질환의 핵심 결정인자로 생각됩니다.또한 일부 바이러스는 유두종 바이러스, HIV 및 SARS-CoV-236,39와 같은 바이러스 및 세포 전사를 조절하기 위해 BRD4를 표적으로 합니다.
PDPL을 사용하여 BRD4 상호 작용을 매핑하기 위해 miniSOG를 BRD4의 짧은 N 또는 C 말단 동형과 결합했습니다.Proteomic 결과는 두 구성 사이에 높은 수준의 중첩을 보여주었습니다(보충 그림 9a).miniSOG-H2B로 확인된 핵 프로테옴은 BRD4와 상호 작용하는 단백질의 77.6%를 차지합니다(보충 그림 9b).그런 다음 서로 다른 조명 시간(2, 5, 10, 20분)을 사용하여 마커 반경을 조정했습니다(그림 4a 및 보충 데이터 3).우리는 더 짧은 광주기에서 PDPL이 주로 직접 결합 파트너에 라벨을 붙이고 더 긴 기간에는 라벨링 복합체의 간접적인 표적뿐만 아니라 더 짧은 광활성화 기간 동안 식별된 단백질을 포함할 것이라고 결론지었습니다.사실, 우리는 인접한 시점 사이에 강한 중첩을 발견했습니다(2분과 5분 동안 84.6%, 5분과 10분 동안 87.7%, 10분과 20분 동안 98.7%)(그림 4b 및 보충 그림 9c).모든 실험 그룹에서 우리는 BRD4 자체 라벨링뿐만 아니라 문자열 데이터베이스에 주석이 달린 MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A 및 HMGB1과 같은 몇 가지 알려진 대상을 발견했습니다.이러한 표적의 이온 강도는 노출 시간에 비례합니다(그림 4c 및 보충 그림 9d).2분 그룹에서 확인된 단백질의 GO 분석은 확인된 단백질이 핵에 국한되어 염색질 리모델링 및 RNA 중합효소 기능에 관여하는 것으로 나타났습니다.단백질의 분자 기능은 BRD4 기능과 일치하는 염색질 결합 또는 전사 공동 활성화가 풍부했습니다(그림 4d).문자열 데이터베이스 지원 단백질 상호 작용 분석은 BRD4 및 HDAC 결합 아세틸화 히스톤과 일치하는 SIN3A, NCOR2, BCOR 및 SAP130(그림 4e 및 보충 그림 9e)과 같은 BRD4와 HDAC 계열 상호 작용 복합체 간의 간접 상호 작용의 첫 번째 수준을 보여주었습니다. ..또한 Sin3A, NSUN2, Fus 및 SFPQ를 포함하여 LC-MS/MS에 의해 식별된 대표적인 표적은 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었습니다(그림 4f).최근에, BRD4의 짧은 동형이 LLPS(액체-액체 상 분리) 특성을 갖는 핵을 형성하는 것으로 보고되었습니다.RNA 결합 단백질 Fus 및 SFPQ는 다양한 세포 과정의 LLPS를 매개하며 여기에서 기록되지 않은 BRD4 결합 단백질로 확인되었습니다.BRD4와 SFPQ 사이의 상호 작용은 공동 면역 침전(co-IP) 실험에 의해 확인되었으며(그림 4g), 추가 조사가 필요한 BRD4 매개 액체-액체 상 분리에 대한 또 다른 메커니즘을 제안합니다.종합하면, 이러한 결과는 PDPL이 알려지지 않은 결합 단백질뿐만 아니라 상호작용하는 알려진 BRD4를 식별하기 위한 이상적인 플랫폼임을 시사합니다.
a miniSOG 매개 BRD4 근접 마킹, 노출 시간: 2, 5, 10 및 20분의 도식적 표현.b 다른 조명 시간에서 확인된 단백질의 겹침.HEK293T-miniSOG-BRD4에서 확인된 단백질 농축은 야생형 HEK293T와 비교하여 통계적으로 유의했습니다.c 지정된 노출 시간 동안 표지되지 않은 대표적인 알려진 BRD4 결합 단백질을 정량화할 때의 이온 강도.n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플.데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다.d 2분 그룹에서 확인된 단백질의 유전자 존재론적 분석(GO).처음 10개의 GO 용어가 나열됩니다.기포는 GO 용어 범주에 따라 색상이 지정되며, 기포 크기는 각 용어에서 발견되는 단백질 수에 비례합니다.e BRD4와 상호작용하는 단백질의 스트링 분석.노란색 원은 직접 접착제이고 회색 원은 간접 접착제의 첫 번째 레이어입니다.빨간색 선은 실험적으로 결정된 상호 작용을 나타내고 파란색 선은 예측된 상호 작용을 나타냅니다.f LC-MS/MS에서 확인된 대표적인 BRD4 결합 표적을 웨스턴 블롯팅으로 확인했습니다.g 공동 면역 침전 실험은 SFPQ와 BRD4 사이의 상호 작용을 확인합니다.이 실험은 유사한 결과로 최소 두 번 독립적으로 반복되었습니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일의 형태로 제공됩니다.
등록되지 않은 POI 관련 표적을 식별하는 것 외에도 우리는 PDPL이 효소에 대한 기질을 식별하는 데 적합할 것이라고 가정합니다.Parkin(PARK2에 의해 인코딩됨)은 E3 리가아제이며 파킨의 돌연변이는 상염색체 열성 소아 파킨슨병(AR-JP)42을 유발하는 것으로 알려져 있습니다.또한 파킨은 미토파지(미토콘드리아 자가포식) 및 활성산소 제거에 필수적인 것으로 설명되었습니다.그러나 여러 파킨 기질이 확인되었지만 이 질병에서 파킨의 역할은 아직 명확하지 않습니다.특성화되지 않은 기질에 주석을 달기 위해 PDPL은 파킨의 N- 또는 C-말단에 miniSOG를 추가하여 테스트되었습니다.세포는 PINK1-Parkin 경로를 통해 파킨을 활성화하기 위해 카르보닐 시안화물 양성자 수송체 m-클로로페닐히드라존(CCCP)으로 처리되었습니다.BRD4 PDPL 결과와 비교하여 파킨 N-말단 융합은 C-말단의 더 많은 부분(210개 중 177개)을 덮었지만 더 큰 표적 단백질 세트를 드러냈습니다(그림 5a, b 및 보충 데이터 4).결과는 N-말단 태그가 Parkin44를 비정상적으로 활성화할 수 있다는 보고와 일치합니다.놀랍게도 Parkin43에 대한 AP-MS 결과가 발표된 우리 데이터에는 18개의 중복 단백질만 있었는데, 이는 세포주와 단백질체학 워크플로 간의 차이 때문일 수 있습니다.4개의 알려진 단백질(ARDM1, HSPA8, PSMD14 및 PSMC3) 외에 두 가지 방법으로 확인되었습니다(그림 5c)43.LC-MS/MS의 결과를 추가로 검증하기 위해 PDPL 처리 및 후속 웨스턴 블롯팅을 사용하여 HEK293T 모세포 분석 결과와 안정한 N-말단 파킨 라인을 비교했습니다.이전에 알려지지 않은 표적 CDK2, DUT, CTBP1 및 PSMC4는 알려진 결합제인 DNAJB1로 테스트되었습니다(그림 5d).
파킨의 N- 또는 C-말단에 융합된 안정적으로 발현된 miniSOG가 있는 HEK293T 세포에서 파킨-상호작용 단백질의 화산 플롯(n = 3개의 독립적인 생물학적 실험).양측 스튜던트 t-검정은 화산 플롯에 사용되었습니다.HEK293T를 음성 대조군으로 사용했습니다. 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 >2배 이온 강도 차이). 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 >2배 이온 강도 차이). 더 보기 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 >2배 이온 강도 차이).显着变化的蛋白质以红色突出显示(p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异)。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной). 크게 변경된 단백질은 빨간색으로 강조 표시됩니다(p < 0.05 및 > 2배 이온 강도 차이).HEK293T-miniSOG에는 중요하지만 HEK293T에는 중요하지 않은 관련 단백질은 녹색으로 표시됩니다.b N-말단과 C-말단 구성물 사이에 겹치는 단백질을 보여주는 벤 다이어그램.N-말단 태그는 파킨을 비정상적으로 활성화하여 더 많은 인식 가능한 단백질을 생성할 수 있습니다.c PDPL과 AP-MS 사이의 겹치는 단백질을 보여주는 벤 다이어그램.18개의 중복 단백질 중 4개 및 PDPL에서 구체적으로 확인된 159개 단백질 중 11개를 포함하여 알려진 상호작용자가 나열됩니다.d LC-MS/MS로 식별된 대표적인 표적은 웨스턴 블롯팅으로 확인했습니다.e Ssu72 및 SNW1은 미등록 파킨 기질로 확인되었습니다.이러한 FLAG 태그가 지정된 단백질 플라스미드를 HEK293T 및 HEK293T-Parkin-miniSOG에 형질감염시킨 후 다양한 시점에서 CCCP 처리하였다.분해는 파킨 과발현 라인에서 더 두드러졌다.f 프로테아좀 억제제 MG132를 사용하여 Ssu72 및 SNW1의 분해 과정이 프로테아좀-유비퀴틴화에 의해 매개됨을 확인했습니다.이 실험은 유사한 결과로 최소 두 번 독립적으로 반복되었습니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일의 형태로 제공됩니다.
특히 PDPL에 의해 확인된 단백질에는 파킨 결합 단백질과 그 기질이 포함되어야 합니다.등록되지 않은 파킨 기질을 검출하기 위해 우리는 7개의 확인된 단백질(PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 및 SNW1)과 형질감염된 플라스미드를 선택하여 이들 유전자를 정상 HEK293T에 노출시키고 miniSOG-Parkin의 HEK293T 처리 후 안정적으로 발현합니다.Ssu72 및 SNW1 단백질의 수준은 안정적인 miniSOG-Parkin 계통에서 유의하게 감소했습니다(그림 5e).12시간 동안 CCCP로 처리한 결과 두 기질 모두가 가장 현저하게 분해되었습니다.Ssu72 및 SNW1의 분해가 proteasome-ubiquitination에 의해 조절되는지 여부를 조사하기 위해 proteasome 억제제 MG132를 첨가하여 proteasome 활성을 억제했으며 실제로 분해 과정이 억제되었음을 발견했습니다 (그림 5f).추가 비 기질 표적은 Western blotting(보충 그림 10)을 사용하여 Parkin 상호 작용자로 확인되었으며, 이는 LC-MS/MS와 일관된 결과를 보여주었습니다.결론적으로 PDPL 워크플로우와 표적 단백질 형질감염 검증의 통합으로 미등록 E3 리가제 기질을 식별할 수 있습니다.
우리는 공간과 시간에서 상호 작용하는 POI를 식별할 수 있는 공통 근접 마킹 플랫폼을 개발했습니다.플랫폼은 약 12kDa에 불과한 miniSOG 감광제 단백질을 기반으로 하며, 성숙한 APEX2 효소 크기(27kDa)의 절반 미만이고 TurboID 크기(35kDa)의 1/3에 불과합니다.더 작은 크기는 작은 단백질 상호작용체를 연구하기 위한 응용 범위를 크게 확장해야 합니다.일중항 산소의 양자 수율을 높이고 이 접근 방식의 감도를 확장하려면 유전적으로 암호화된 단백질이든 작은 분자이든 추가 감광제에 대한 추가 조사가 필요합니다.현재 버전의 miniSOG의 경우 파란색 조명을 사용하여 근접 마커를 활성화하여 높은 시간 해상도를 얻을 수 있습니다.또한 노출 시간이 길수록 일중항 산소의 더 큰 "구름"이 방출되어 더 많은 원위 히스티딘 잔류물이 수정되고 라벨링 반경이 증가하며 PDPL 공간 분해능을 미세 조정할 수 있습니다.우리는 또한 신호 대 배경 비율을 증가시키기 위해 7개의 화학 프로브를 테스트했으며 이 접근 방식 뒤에 있는 분자 메커니즘을 탐구했습니다.편향되지 않은 공개 검색과 결합된 TOP-ABPP 워크플로는 루프 영역에서 히스티딘에 대한 적당한 선호도를 제외하고는 히스티딘에서만 수정이 발생하고 증가된 히스티딘 수정에 대해 일관된 미세 환경이 관찰되지 않았음을 확인했습니다.
PDPL은 또한 다른 근접 라벨링 및 세포 소기관 특이적 화학 프로브 방법에 필적하는 프로테옴 특이성 및 적용 범위를 가진 세포내 프로테옴을 특성화하는 데 사용되었습니다.근접 마커는 또한 표면, 리소좀 및 분비체 관련 프로테옴을 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다46,47.우리는 PDPL이 이러한 세포 소기관과 호환될 것이라고 믿습니다.또한, 우리는 동적 특성과 더 많은 시간적 상호 작용에 관여하기 때문에 막 결합 단백질보다 더 복잡한 세포질 단백질 결합의 표적을 식별하여 PDPL에 도전했습니다.PDPL은 전사 보조 활성화제 BRD4와 질병 관련 리가제 E3 Parkin의 두 가지 단백질에 적용되었습니다.이 두 단백질은 기본적인 생물학적 기능뿐만 아니라 임상적 관련성과 치료 가능성 때문에 선택되었습니다.이 두 POI에 대해 잘 알려진 바인딩 파트너와 등록되지 않은 대상이 식별되었습니다.특히, 상 분리 관련 단백질 SFPQ는 co-IP에 의해 확인되었으며, 이는 BRD4(짧은 이소폼)가 ​​LLPS를 조절하는 새로운 메커니즘을 나타낼 수 있습니다.동시에 우리는 Parkin 기질의 식별이 간접 접착제의 식별이 필요한 시나리오라고 믿습니다.우리는 두 개의 미확인 파킨 기질을 확인하고 유비퀴틴화-프로테아좀 경로를 따라 분해를 확인했습니다.최근에는 하이드롤라제 기질을 효소로 포획하여 검출하는 메커니즘 기반 트래핑 전략이 개발되었습니다.이것은 매우 강력한 방법이지만 큰 복합체 형성에 관여하는 기질 분석에는 적합하지 않으며 효소와 기질 사이의 공유 결합 형성이 필요합니다.우리는 PDPL이 데유비퀴티나아제 및 메탈로프로테아제 계열과 같은 다른 단백질 복합체 및 효소 계열을 연구하도록 확장될 수 있을 것으로 기대합니다.
SOPP3라고 하는 새로운 형태의 miniSOG는 개선된 일중항 산소 생산으로 개발되었습니다.우리는 miniSOG를 SOPP3와 비교했으며 신호 대 잡음비가 변경되지 않았지만 개선된 마킹 성능을 발견했습니다(보충 그림 11).우리는 SOPP3의 최적화(예: 유도 진화를 통해)가 더 짧은 조명 시간을 필요로 하는 더 효율적인 감광제 단백질로 이어질 것이며 따라서 더 동적인 세포 과정이 캡처될 수 있다고 가정했습니다.특히, PDPL의 현재 버전은 청색광 조명이 필요하고 깊은 조직을 관통할 수 없기 때문에 세포 환경에 제한됩니다.이 기능은 동물 모델 연구에서 사용할 수 없습니다.그러나 PDPL과 광유전학의 조합은 특히 뇌에서 동물 연구의 기회를 제공할 수 있습니다.또한, 다른 엔지니어링된 적외선 감광제도 이러한 제한을 제거합니다.현재 이 분야에 대한 연구가 진행 중입니다.
HEK293T 세포주는 ATCC(CRL-3216)로부터 입수하였다.세포주는 마이코플라스마 감염에 대해 음성으로 테스트되었으며 10% 소 태아 혈청(FBS, Vistech, #SE100-B) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone, #SV30010)이 보충된 DMEM(Thermo, #C11995500BT)에서 배양되었습니다.에서 성장했다.
3-아미노페닐렌(샘플 3) 및 (4-에티닐페닐)메탄아민(샘플 4)은 Bidepharm에서 구입했습니다.프로필아민(프로브 2)은 Energy-chemicals에서 구입했습니다.N-(2-아미노페닐)펜트-4-인아미드(프로브 1)는 공개된 방법에 따라 합성되었습니다.
보충 표 1은 이 연구에 사용된 유전자 구성을 나열합니다.miniSOG 및 KillerRed 서열은 P. Zou(Peking University)의 선물 플라스미드에서 복제되었습니다.미토콘드리아 기질 표적화 서열은 COX4의 23 N-말단 아미노산에서 유래되었고 Gibson 어셈블리(Beyotime, #D7010S)를 사용하여 표시된 벡터에 클로닝되었습니다.소포체의 막과 핵을 표적화하기 위해 HEK293T 세포의 cDNA 라이브러리에서 PCR로 증폭한 SEC61B 인간 DNA(NM_006808.3)(NEB, #M0491L) 및 H2B DNA(D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory 기증) 위에서 언급했듯이 복제되었습니다.달리 명시되지 않는 한, 안정적인 세포주의 형질전환 및 구축에 사용된 다른 단백질 유전자는 HEK293T 세포 cDNA 라이브러리로부터 PCR 증폭되었다.G3S(GGGS) 및 G4S(GGGGS)는 미끼 단백질과 miniSOG 사이의 링커로 사용되었습니다.V5 에피토프 태그(GKPIPNPLLGLDST)가 이러한 융합 작제물에 추가되었습니다.포유동물에서의 발현 및 안정한 세포주를 확립하기 위해, miniSOG 융합 작제물을 pLX304 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝하였다.박테리아 발현을 위해 miniSOG는 C-말단에서 6xHis로 표지된 pET21a 벡터에 클로닝되었습니다.
HEK293T 세포를 6웰 플레이트에 웰당 2.0 x 105개 세포로 시딩하고 24시간 후 재조합 렌티바이러스 플라스미드(2.4㎍ pLX304) 및 바이러스 패키징 플라스미드(1.5㎍ psPAX2 및 1.2㎍ pMD2.G)를 사용하여 24시간 후 형질감염시켰다. , #C0533), 약 80% 융합.밤새 형질감염시킨 후, 배지를 교체하고 추가로 24시간 동안 인큐베이션하였다.바이러스 수집은 24, 48, 72시간 후에 수행하였다.표적 세포주를 감염시키기 전에 바이러스 배지를 0.8μm 필터(Merck, #millex-GP)를 통해 여과하고 폴리브렌(Solarbio, #H8761)을 8㎍/ml의 농도로 첨가하였다.24시간 후, 배지를 교환하여 세포를 회복시켰다.더 낮은 엄격한 선택으로서 처음 3개의 계대에 대해 5㎍/ml 블라스티시딘(Solarbio, #3513-03-9)을 사용하여 세포를 선택하였다.그런 다음 다음 세 계대에 대한 보다 엄격한 처방으로 20μg/ml를 사용했습니다.
세포를 12웰 챔버(Ibidi, #81201)에 웰당 약 20,000개 세포의 밀도로 시딩했습니다.HEK293T 세포의 접착력을 향상시키려면 37°C에서 인산염 완충 식염수(PBS, Sangon, #B640435)에 희석된 50μg/ml 피브로넥틴(Corning, #356008)을 추가합니다.챔버를 1시간 동안 전처리한 후 PBS로 제거하였다.24시간 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 37°C에서 1시간 동안 신선한 Hanks' 균형 염 용액(HBSS, Gibco, #14025092)에서 1mM 프로브 3으로 배양한 다음 파란색 LED(460nm ).)를 실온에서 10분 동안 조사하였다.그 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS(Sangon, #E672002)에 녹인 4% 포름알데히드로 상온에서 15분간 고정하였다.PBS로 3회 세척하여 고정된 세포에서 과량의 포름알데히드를 제거하였다.그런 다음 세포를 PBS 중 0.5% Triton X-100(Sangon, #A600198)으로 투과화하고 PBS로 3회 세척했습니다.그런 다음 챔버를 제거하고 50μM Cy3-azide(Aladdin, #C196720), 2mM CuSO4(Sangon, #A603008), 1mM BTTAA(Confluore, #BDJ-4)를 포함하는 클릭 반응 혼합물 25μl를 각 샘플에 추가합니다. 및 0.5 mg/ml 아스코르브산나트륨(Aladdin, no. S105024)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.스냅 반응 후, 세포를 0.05% Tween-20(Sangon, #A600560)(PBST)이 포함된 PBS로 6회 세척한 다음, PBST 중 5% BSA(Abcone, #B24726)로 실온에서 30분 동안 차단하였다.
공동국재화 면역염색을 위해, 세포를 표시된 조건에 따라 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다: 마우스 항-V5 태그 mAb(1:500, CST, #80076), 토끼 항-Hsp60 mAb(1:1000), ABclonal, #A0564), 토끼 다클론 항칼넥신 항체(1:500, Abcam, #ab22595) 또는 토끼 항라민 A/C 단클론항체(1:500; CST, #2032)를 4°C에서 밤새.PBST로 3회 세척한 후 세포를 2차 항체와 함께 인큐베이션했습니다: 1:1000으로 희석된 염소 항-토끼 Alexa Fluor 488(Thermo, #A11034), 1:1000으로 희석된 염소 항-마우스 Alexa Fluor 594(CST, #8889).희석 실온에서 30분간 희석한다.그런 다음 세포를 PBST로 3회 세척하고 PBS 중 DAPI(Thermo, #D1306)로 실온에서 10분 동안 대조염색했습니다.PBS로 3회 세척한 후, 세포를 영상화를 위해 PBS 중 50% 글리세롤(Sangon, #A600232)에 밀봉하였다.ZEISS LSM 900 Airyscan2 공초점 현미경과 ZNE 3.5 소프트웨어를 사용하여 면역형광 이미지를 얻었습니다.
일중항 산소 형광 이미징을 위해 세포를 Hanks HEPES 완충액(DOJINDO, #MT05)에 100nM Si-DMA를 첨가하기 전에 Hanks HEPES 완충액으로 두 번 세척했습니다.빛에 노출된 후 세포를 37°C의 CO2 인큐베이터에서 45분 동안 인큐베이션했습니다.그런 다음 세포를 Hanks' HEPES 완충액으로 2회 세척하고 실온에서 10분 동안 Hanks' HEPES 완충액에서 Hoechst로 대조염색하고 ZEISS LSM 900 공초점 현미경을 사용하여 시각화했습니다., #M36008) 칼슘과 마그네슘을 함유하는 HBSS 완충액에서.빛 또는 독소루비신(MCE, #HY-15142A)에 노출된 후, 세포를 37℃의 CO2 인큐베이터에서 10분 동안 인큐베이션하고, HBSS 완충액으로 2회 세척하고, 실온에서 HBSS 완충액에서 Hoechst와 함께 인큐베이션하였다.분.독소루비신은 세포가 30분 동안 1% BSA를 함유하는 HBSS에서 20μM 독소루비신으로 처리된 양성 프로브 대조군으로 사용되었습니다.Zeiss LSM 900 공초점 현미경을 사용하여 면역형광 이미지를 얻었다.
mito-miniSOG를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 15cm 접시에 약 30%의 밀도로 시딩했습니다.48시간 후, ~80% 합류에 도달했을 때, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 37°C에서 1시간 동안 신선한 HBSS 완충액에서 1mM 프로브 3과 함께 인큐베이션한 다음, 실온에서 10분 동안 청색 LED로 조명했습니다. 온도..그 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 긁어내고 EDTA가 없는 프로테아제 억제제(MCE, #HY-K0011)를 함유하는 빙냉 PBS 완충액에 재현탁시켰다.팁을 1분 동안 초음파 처리하여 세포를 용해했습니다(35% 진폭에서 1초 켜기 및 1초 끄기).생성된 혼합물을 4°C에서 10분 동안 15,871 xg에서 원심분리하여 파편을 제거하고 상청액 농도를 BCA 단백질 분석 키트(Beyotime, #P0009)를 사용하여 4 mg/mL로 조정했습니다.위의 용해물 1ml를 0.1mM 광분해성 비오틴 아지드(Confluore, #BBBD-14), 1mM TCEP(Sangon, #A600974), 0.1mM TBTA 리간드(Aladdin, #T162437) 및 바닥이 있는 1mM CuSO4 인큐베이터와 결합합니다. 실온에서 1시간 동안 회전시킨다.스냅 반응 후, 혼합물을 10ml 유리 바이알에 미리 혼합된 용액(MeOH:CHCl3:H2O = 4ml:1ml:3ml)에 추가합니다.샘플을 혼합하고 실온에서 10분 동안 4500g에서 원심분리하였다.하부 및 상부 용액을 버리고 침전물을 1 ml의 메탄올로 2회 세척하고 4℃에서 5분 동안 15871 xg에서 원심분리하였다.25mM 중탄산암모늄(ABC, Aladdin, 번호 A110539)에 8M 요소(Aladdin, no. U111902) 1ml를 첨가하여 침전물을 용해시킵니다.샘플을 55°C에서 40분 동안 10mM 디티오트레이톨(Sangon, #A100281 25mM ABC)으로 재구성한 다음, 실온에서 암실에서 15mM 신선한 요오도아세트아미드(Sangon, #A600539)를 첨가했습니다.30분 이내에 알킬화..추가 5mM 디티오트레이톨을 첨가하여 반응을 중지시켰다.1 ml PBS로 3회 세척하여 각 샘플에 대해 약 100 μl의 NeutrAvidin 아가로스 비드(Thermo, #29202)를 준비합니다.상기 프로테옴 용액을 5 ml PBS로 희석하고 미리 세척된 NeutrAvidin 아가로스 비드와 함께 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.그런 다음 비드를 0.2% SDS(Sangon, #A600485)를 포함하는 5ml PBS로 3회, 1M 요소를 포함하는 5ml PBS로 3회, 5ml ddH2O로 3회 세척했습니다.그 다음, 비드를 원심분리에 의해 수확하고 1M 요소, 1mM CaCl2(Macklin, #C805228) 및 20ng/㎕ 트립신(Promega, #V5280)을 함유하는 25mM ABC 200㎕에 재현탁시켰다.회전하면서 37°C에서 밤새 트립신화합니다.pH가 2-3에 도달할 때까지 포름산(Thermo, # A117-50)을 첨가하여 반응을 중단시켰다.비드를 0.2% SDS가 포함된 PBS 1ml로 3회, 1M 요소가 포함된 PBS 1ml로 3회, 증류수 1ml로 3회 세척하였다.변형된 펩티드는 200㎕의 70% MeOH를 사용하여 90분 동안 광 용해(365 nm)에 의해 방출되었다.원심분리 후, 상층액을 수집하였다.그런 다음 비드를 100㎕의 70% MeOH로 1회 세척하고 상청액을 모았다.샘플을 Speedvac 진공 농축기에서 건조하고 분석할 때까지 -20°C에서 보관했습니다.
일중항 산소 변형 펩티드를 확인하고 정량화하기 위해 샘플을 0.1% 포름산에 재용해하고 1μg의 펩티드를 Tune의 나노 ESI 소스와 공급업체 소프트웨어 4.3의 Xcalibur가 장착된 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분석기를 사용하여 분석했습니다.샘플은 3µm C18 물질(ReproSil-pur, #r13.b9.)이 포함된 75µm × 15cm 내부 충전 모세관 컬럼에서 분리되었고 EASY-nLC 1200 UHPLC 시스템(Thermo)에 연결되었습니다.펩티드는 선형 95분 구배 크로마토그래피에 의해 8% 용매 B에서 50% 용매 B로 분리되었습니다(A = 물 중 0.1% 포름산, B = 80% 아세토니트릴 중 0.1% 포름산), 그 다음 98% B min까지 선형으로 증가했습니다. 300nl/min의 유속에서 6분.Orbitrap Fusion Lumos는 데이터에 따라 전체 MS 스캔과 MS2 스캔을 번갈아 가며 데이터를 수집합니다.스퍼터링 전압은 2.1kV로 설정되었고 이온 수송 모세관의 온도는 320℃였다.MS 스펙트럼(350-2000m/z)은 120,000의 분해능, AGC 4 × 105, 최대 입력 시간 150ms로 수집되었습니다.각 전체 스캔에서 가장 일반적인 다중 하전 전구체 10개는 30%의 정규화된 충돌 에너지, 1.6m/z의 사중극자 격리 창 및 30,000의 분해능 설정으로 HCD를 사용하여 조각화되었습니다.5×104 및 최대 입력 시간 150ms를 사용하는 직렬 질량 분석을 위한 AGC 타겟.동적 예외는 30초로 설정됩니다. 할당되지 않은 이온 또는 1+ 및 >7+ 전하를 갖는 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다. 할당되지 않은 이온 또는 1+ 및 >7+ 전하를 갖는 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 할당되지 않은 이온 또는 1+ 및 >7+ 전하를 갖는 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 지정되지 않은 이온 또는 전하가 1+ 및 >7+인 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다.
원시 데이터는 MSFragger 기반의 FragPipe 컴퓨팅 플랫폼을 사용하여 처리됩니다.-150 ~ 500 Da의 전구체 질량 허용 오차를 갖는 공개 검색 알고리즘을 사용하여 질량 편향 및 해당 아미노산을 결정했습니다.그런 다음 PD(Proteome Discoverer 2.5, Thermo)에서 질량 증가가 +229.0964 및 +247.1069 Da인 히스티딘 변형을 사용하여 변형된 펩티드를 확인했습니다.
융합된 miniSOG 유전자를 안정적으로 발현하는 세포를 6 cm 접시에 플레이팅하였다.~80% 합류에 도달하면 세포를 HBSS(Gibco, #14025092)로 한 번 세척한 다음 HBSS에서 화학 프로브와 함께 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하고 청색광으로 조명했습니다.실온에서 20분 동안 10W LED.PDPL, 0.5mM 비타민 C(MCE, #HY-B0166), 5mM Trolox(MCE, #HY-101445), D2O(Sigma, #7789-20-0), 100mM 만니톨(Energy Chemical, #69-65-8), 100μM H2O2, 10mM NaN3를 보충제로 세포에 첨가했습니다.차가운 PBS로 세척한 후, 세포를 긁어내고 1.5ml 원심분리 튜브에 수집하고 EDTA가 없는 1x 프로테아제 억제제가 포함된 PBS 200μl에서 팁으로 1분 동안 초음파 처리했습니다(1초 및 1초, 진폭 35%).생성된 혼합물을 4 °C에서 10분 동안 15,871 x g에서 원심분리하고 상청액 농도를 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 1 mg/mL로 조정했습니다.대략 50㎕의 상기 용해물을 0.1mM 로다민 아지드(Aladdin, no. T131368), 1mM TCEP, 0.1mM TBTA 리간드 및 1mM CuSO4와 함께 실온에서 1시간 동안 아래에서 위로 회전하면서 인큐베이션하였다.클릭 반응 후, 샘플에 미리 냉각된 아세톤 250㎕를 첨가하고 -20℃에서 20분 동안 인큐베이션하고 4℃에서 6010xg에서 10분 동안 원심분리하여 아세톤으로 침전을 수행하였다.펠릿을 수집하고 95°C에서 10분 동안 1x Laemmli의 완충액 50 μl로 끓입니다.그런 다음 샘플을 SDS-PAGE 긴 젤에서 분석하고 Image Lab Touch 소프트웨어와 함께 Bio-rad ChemiDoc MP Touch 이미징 시스템을 사용하여 시각화했습니다.
재조합 miniSOG-6xHis 단백질의 발현 및 정제는 전술한 바와 같이 수행하였다.요약하면, E. coli BL21(DE3) 세포(TransGen, #CD701-02)를 pET21a-miniSOG-6xHis로 형질전환하고 0.5mM IPTG(Sangon, #A600168)로 단백질 발현을 유도하였다.세포 용해 후, 단백질을 Ni-NTA 아가로스 비드(MCE, no. 70666)를 사용하여 정제하고 PBS에 대해 투석하고 -80°C에서 보관했습니다.
항체 기반 시험관 내 라벨 근접 분석의 경우 PBS에서 100 μM 정제된 miniSOG, 1 mM 프로브 3 및 1 μg 항-라벨 마우스 모노클로날 항체(TransGen, #HT501-01)를 총 반응 부피 50 μl로 혼합합니다..반응 혼합물에 실온에서 0, 2, 5, 10 및 20분 동안 청색 LED 광을 조사하였다.혼합물을 0.1mM 비오틴-PEG3-아지드(Aladdin, #B122225), 1mM TCEP, 0.1mM TBTA 리간드 및 1mM CuSO4와 함께 실온에서 상향 이동 진탕기에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다.스냅 반응 후 4x Laemmli's 버퍼를 혼합물에 직접 추가하고 95°C에서 10분 동안 끓입니다.샘플을 SDS-PAGE 겔에서 분석하고 스트렙타비딘-HRP(1:1000, Solarbio, #SE068)를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 분석했습니다.
C-말단 아미드화(LHDALDAK-CONH2)가 있는 히스티딘 함유 합성 펩타이드를 사용하여 인근 펩타이드 기반 시험관내 표지를 분석했습니다.이 분석에서, 100μM 정제된 miniSOG, 10mM 프로브 3 및 2μg/ml 합성 펩티드를 PBS에서 50μl의 총 반응 부피로 혼합하였다.반응 혼합물에 실온에서 1시간 동안 청색 LED 광을 조사하였다.LC-MS 시스템(Waters, MassLynx 스펙트럼 분석 소프트웨어가 있는 SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight 질량 분석기)을 사용하여 샘플 1마이크로리터를 분석했습니다.
miniSOG 융합 유전자를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 10cm 접시에 다른 세포 소기관 국소화(Mito, ER, Nucleus)가 있는 계통에, 파킨-miniSOG 및 BRD4-miniSOG 계통에 대해 15cm 접시에 접종했습니다.~90% 합류에 도달하면 세포를 HBSS로 한 번 세척한 다음 HBSS에서 프로브 3과 함께 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하고 실온에서 10W 청색 LED로 조명했습니다.Parkin의 비접촉 라벨링을 위해 HBSS에 프로브 3이 포함된 10μM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP(Solarbio, #C6700)를 37°C에서 1시간 동안 추가했습니다.세포 용해, 클릭 화학, 환원 및 알킬화 단계는 2 mg의 용해물을 첨가하고 클릭 반응에 광분해성 비오틴 아지드 대신 바이오틴 PEG3 아지드를 사용한 것을 제외하고는 전술한 바와 동일하였다.농축 후, 비드를 0.2% SDS를 포함하는 PBS 5ml로 3회, 1M 요소를 포함하는 PBS 5ml로 3회, PBS 5ml로 3회 세척했습니다.그 후, 1M 우레아를 함유하는 300㎕ 25mM ABC에 2㎍ 트립신을 첨가하여 37℃에서 밤새 단백질을 절단하였다.pH 2-3에 도달할 때까지 포름산을 첨가하여 반응을 중단시켰다.비드에 트립신 처리한 후, 펩타이드 용액을 SOLAµ HRP 컬럼(Thermo, #60209-001)을 사용하여 탈염하고 Speedvac 진공 농축기에서 건조했습니다.펩티드는 0.1% 포름산에 재용해되었고 500ng의 펩티드는 위에서 설명한 나노-ESI 소스가 장착된 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분석기를 사용하여 분석되었습니다.펩티드는 상업용 RP-HPLC 예비 컬럼(75μm x 2cm)(Thermo, no. 164946)과 분석용 RP-HPLC 컬럼(75μm x 25cm)(Thermo, no. 164941)에서 분리되었으며 둘 다 2μm로 채워져 있습니다.60분 내에 8%에서 35% ACN으로의 구배, 그 다음 300Nl/min의 유속에서 6분 내에 98% B까지 선형으로 증가합니다.MS 스펙트럼(350-1500m/z)은 60,000의 분해능, AGC 4 × 105, 최대 입력 시간 50ms로 수집되었습니다.선택된 이온은 정규화된 충돌 에너지 30%, 사중극자 격리 창 1.6m/z, 분해능 15000으로 3초 주기로 HCD에 의해 순차적으로 조각화되었습니다. 5 × 104 직렬 질량 분석기 AGC 타겟 및 최대 주입 시간 22ms가 사용되었습니다.동적 제외는 45초로 설정됩니다. 할당되지 않은 이온 또는 1+ 및 >7+ 전하를 갖는 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다. 할당되지 않은 이온 또는 1+ 및 >7+ 전하를 갖는 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 할당되지 않은 이온 또는 1+ 및 >7+ 전하를 갖는 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 지정되지 않은 이온 또는 전하가 1+ 및 >7+인 이온은 MS/MS에 대해 거부되었습니다.
NeutrAvidin 비드 농축까지의 샘플 준비 단계는 위에서 설명한 LC-MS/MS 분석과 동일했습니다.약 50㎍의 용해물이 로딩 제어를 위한 입력으로 사용되었고 2mg의 용해물이 클릭 반응에 사용되었습니다.농축 및 뉴트라비딘으로 세척한 후, 50㎕의 Laemmli's 완충액을 아가로스 수지 비드에 첨가하고 95℃에서 5분 동안 끓임으로써 결합된 단백질을 용출시켰다.대조군 부하 입력 및 비드 농축 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고 표준 웨스턴 블롯 방법에 의해 PVDF 막(Millipore, #ISEQ00010)으로 옮겼습니다.막을 0.1% 트윈-20(TBST)을 함유하는 TBS에서 5% 탈지유(Sangon, #A600669)로 차단하고 1차 및 2차 항체와 순차적으로 인큐베이션했습니다.1차 항체를 TBST의 5% 탈지유에 1:1000으로 희석하고 4°C에서 밤새 배양했습니다.2차 항체는 1:5000의 비율로 사용하였고 상온에서 1시간 동안 배양하였다.Chemidoc MP 이미징 시스템을 사용하여 화학 발광에 의해 멤브레인을 시각화했습니다.그림에서 오점 및 젤의 절단되지 않은 모든 스캔은 원시 데이터로 표시됩니다.
본 연구에 사용된 1차 항체는 토끼 항-SFPQ 단클론항체(CST, no. 71992), 토끼 항-FUS 단클론항체(CST, no. 67840), 토끼 항-NSUN2 다클론항체(Proteintech, no. 20854-1- AP), 토끼 항mSin3A 다클론항체(Abcam, #ab3479), 마우스 항태그 단클론항체(TransGen, #HT201-02), 마우스 항β-액틴 단클론항체(TransGen, #HC201-01), 토끼항 -CDK2 단클론항체(ABclonal, #A0094), CTBP1에 대한 토끼 단클론항체(ABclonal, #A11600), DUT에 대한 토끼 다클론항체(ABclonal, #A2901), PSMC4에 대한 토끼 다클론항체(ABclonal, #A2505), 토끼 항- DNAJB1 폴리클로날 항체(ABclonal, # A5504).이 항체는 TBST의 5% 탈지유에 1:1000 희석하여 사용했습니다.이 연구에 사용된 2차 항체에는 1:5000 희석의 항-토끼 IgG(TransGen, #HS101-01), 항-마우스 IgG(TransGen, #HS201-01)가 포함되었습니다.
BRD4가 SFPQ와 상호 작용하는지 여부를 추가로 조사하기 위해 HEK293T를 과발현하는 안정한 HEK293T 및 BRD4-miniSOG 세포를 10cm 접시에 플레이팅했습니다.세포를 차가운 PBS로 세척하고 4°C에서 30분 동안 EDTA가 없는 프로테아제 억제제가 포함된 1 ml Pierce IP 용해 완충액(Thermo Fisher, #87787)에서 용해시켰다.그 후, 용해물을 1.5 ml 원심분리 튜브에 수집하고 4°C에서 10분 동안 15,871 xg에서 원심분리했습니다.상청액을 수확하고 5㎍의 항-V5 표지된 마우스 모노클로날 항체(CST, #80076)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.0.5% Tween-20을 포함하는 PBS로 두 번 단백질 A/G 자기 비드(MCE, #HY-K0202)의 약 50 μl를 세척합니다.그 다음, 세포 용해물을 바닥에서 위로 회전하면서 4℃에서 4시간 동안 자기 비드와 함께 인큐베이션하였다.그런 다음 비드를 PBST 완충액 1ml로 4회 세척하고 95°C에서 5분 동안 끓였습니다.샘플을 SDS-PAGE 겔에서 분석하고 표준 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 PVDF 막으로 옮겼습니다.막을 TBST의 5% 탈지유에서 차단하고 1차 및 2차 항체와 함께 순차적으로 인큐베이션했습니다.1차 항체 토끼 항-SFPQ 모노클로날 항체(CST, #71992)를 TBST의 5% 탈지유에 1:1000의 비율로 사용하고 4°C에서 밤새 배양했습니다.Anti-rabbit IgG는 1:5000의 비율로 사용하였고 상온에서 1시간 동안 배양하였다.Chemidoc MP 이미징 시스템을 사용하여 화학 발광에 의해 멤브레인을 시각화했습니다.
용매 접근 가능 표면적(SASA) 분석에 사용된 모든 구조는 단백질 데이터 은행(PDB)52 또는 AlphaFold 단백질 구조 데이터베이스53에서 얻었습니다.FreeSASA 프로그램을 사용하여 각 잔류물에 대해 절대 SASA를 계산했습니다.표지된 히스티딘 및 그 이웃에 대한 완전하고 모호하지 않은 SASA 데이터만 각 구조에 대한 평균 SASA를 얻는 데 사용되었습니다.각 히스티딘에 대한 상대 용매 접근성(RSA)은 절대 SASA 값을 용매에 사용할 수 있는 경험적 최대 가능한 잔류 표면적으로 나누어 계산했습니다.그런 다음 모든 히스티딘은 평균 RSA가 20% 미만이면 숨겨진 것으로 분류되고 그렇지 않으면 노출됩니다56.
DDA 모드에서 얻은 원시 파일은 일반적인 오염 물질을 포함하는 적절한 SwissProt 검증 단백질 데이터베이스에서 Proteome Discoverer(v2.5) 또는 MSfragger(Fragpipe v15.0)를 사용하여 검색되었습니다.펩티드는 2개의 누락된 절단 부위, 고정 변형으로서 카르바모일 메틸화 및 동적 변형으로서 메티오닌 산화를 갖는 완전한 트립신을 필요로 하였다.전구체 및 단편 중량 허용 오차는 각각 10ppm 및 0.02Da(MS2 Orbitrap)로 설정되었습니다. 오염된 히트는 제거되었고 단백질은 <1%의 잘못된 발견 비율을 얻기 위해 여과되었습니다. 오염된 히트는 제거되었고 단백질은 <1%의 잘못된 발견 비율을 얻기 위해 여과되었습니다. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коннфтфи 오염물 히트를 제거하고 단백질을 필터링하여 <1%의 오탐지율을 제공했습니다.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%의 错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения оронвну ложния 오염물 히트를 제거하고 단백질을 여과하여 1% 미만의 위양성률을 달성했습니다.표지를 사용하지 않는 정량 분석을 위해 3개의 생물학적 반복에서 정규화된 단백질 함량을 사용했습니다.단백질 세포내 위치 분석은 DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0의 Gene Ontology(GO) 분석 및 Alice Ting 그룹에서 컴파일 및 게시한 데이터베이스를 사용하여 수행되었습니다.화산 지도는 Perseus(v1.6.15.0)에서 얻었습니다. 양측 t-검정을 사용하여 통계적 유의성에 대해 단백질 존재비 배수 변화를 테스트하고, 단백질 히트는 존재비 변화 >2(달리 언급되지 않는 한) 및 p 값 <0.05로 확인했습니다. 양측 t-검정을 사용하여 통계적 유의성에 대해 단백질 존재비 배수 변화를 테스트하고, 단백질 히트는 존재비 변화 >2(달리 언급되지 않는 한) 및 p 값 <0.05로 확인했습니다. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. 단백질 함량 배수 변화는 양측 t-검정을 사용하여 통계적 유의성에 대해 테스트되었으며 단백질 일치는 함량 변화 >2(달리 언급되지 않는 한) 및 ap 값 <0.05로 확인되었습니다.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中>2使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 化 有 2度 . Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. 단백질 함량의 배수 변화의 통계적 유의성은 양측 t-검정을 사용하여 테스트되었으며 단백질 일치는 함량 변화 >2(달리 표시되지 않는 한) 및 p-값 <0.05에 대해 결정되었습니다.단백질 상호작용 분석은 String 데이터베이스와 함께 GO 분석을 사용하여 수행되었습니다.
3개의 생물학적 복제가 유사한 결과로 수행되었습니다.통계 분석은 GraphPad Prism(GraphPad 소프트웨어)으로 수행되었으며 화산 플롯은 Perseus(v1.6.15.0)로 생성되었습니다.두 그룹을 비교하기 위해 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 p-값을 결정했습니다.화산 플롯에는 실험군에서 2회 이상 확인된 싱글톤 단백질만 포함하였고, 대조군에서 해당 결측값을 정규분포에서 페르세우스로 대체하여 p-값을 계산할 수 있도록 하였다.오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.통계적 분석을 위한 proteomic 분석에서, 적어도 두 번의 생물학적 복제에서 나타난 단백질의 풍부함은 유지되었습니다.통계적 방법은 표본 크기를 미리 결정하는 데 사용되지 않았습니다.실험은 무작위가 아닙니다.연구원들은 실험과 결과 평가 동안 과제에 눈을 떼지 않았습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 연결된 Nature Research Report 초록을 참조하십시오.
이 연구에서 얻은 질량 분석 데이터는 데이터 세트 ID PXD034811(PDPL-MS 데이터 세트)로 iProX57 파트너 리포지토리를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄에 제출되었습니다.원시 데이터는 원시 데이터 파일의 형태로 제공됩니다.이 문서는 원본 데이터를 제공합니다.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 이웃 알아보기: 단백질 복합체를 특성화하고 세포 소기관을 매핑하기 위해 근접성 의존적 비오틴화를 사용합니다. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 이웃 알아보기: 단백질 복합체를 특성화하고 세포 소기관을 매핑하기 위해 근접성 의존적 비오틴화를 사용합니다.Gingras, AS, Abe, KT 및 Raut, B. 주변 환경에 대한 친숙도: 단백질 복합체를 특성화하고 세포 소기관을 매핑하기 위해 근접성 의존성 비오틴화를 사용합니다. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 이웃 이해: 생물학적 생명에 대한 이웃의 의존도를 사용하십시오.Gingras, AS, Abe, KT 및 Raut, B. 근접성 이해: 근접성 의존성 바이오틴화를 사용한 단백질 복합체의 특성화 및 세포소기관 매핑.현재의.내 의견.화학적인.생물학 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Dexter 에너지를 면역 세포에 전달하여 미세 환경 매핑.과학 367, 1091–1097(2020).
Hertling, EL et al.2-프로테옴 규모 네트워크는 인간 상호작용체의 세포별 리모델링을 감지합니다.세포 184, 3022–3040.e3028(2021).