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감염성 질병을 감지하기 위한 전통적인 진단 전략은 현장 진료 테스트(POCT)에 적합하지 않은 벤치탑 기기의 사용을 필요로 합니다.신흥 미세유체학은 빠르고 저렴하며 정확한 현장 진단을 위한 기존 방법에 대한 잠재적인 대안인 고도로 소형화되고 자동화되고 통합된 기술입니다.분자 진단 방법은 가장 효과적인 병원체 검출 방법으로 미세 유체 장치에 널리 사용됩니다.이 검토는 학문적 및 산업적 관점에서 감염성 질병의 미세유체 기반 분자 진단의 최근 발전을 요약합니다.먼저 샘플 전처리, 증폭 및 신호 판독을 포함한 핵산의 일반적인 온칩 처리에 대해 설명합니다.그런 다음 4가지 유형의 미세 유체 플랫폼의 특성, 장점 및 단점을 비교합니다.다음으로, 우리는 핵산의 절대 정량화를 위한 디지털 분석의 사용에 대해 논의할 것입니다.기존 및 최근 상용 미세유체 기반 분자 진단 장치는 모두 현재 시장 상태의 증거로 요약됩니다.마지막으로 감염성 질환의 미세유체 진단의 미래 방향을 제시한다.
전염병은 박테리아, 바이러스, 기생충 등 전 세계에 분포하는 병원체에 의해 발생합니다.다른 질병과 달리 병원체는 접종, 공기 및 수중 매체를 통해 빠르게 감염되어 사람과 숙주 동물 사이에 퍼집니다[1].감염병 예방은 공중 보건 대책으로서 매우 중요합니다.전염병 퇴치를 위한 세 가지 주요 전략: (1) 감염원 통제;(2) 전송 경로의 중단;(3) 감수성 집단의 보호.주요 전략 중 감염원의 통제는 편의성과 저렴한 비용으로 인해 가장 중요한 전략으로 간주됩니다.감염자에 대한 신속한 진단, 격리 및 치료가 매우 중요하며 신속하고 민감하며 정확한 진단 전략이 필요합니다[2].현재의 감염병 진단은 일반적으로 징후와 증상을 기반으로 하는 임상적 검사와 세포 배양, 분자 진단과 같은 실험실 연구를 결합하여 숙련된 인력, 노동 집약적인 절차 및 고가의 검사 장비를 필요로 한다[3, 4].감염병 발병을 예방하기 위해서는 특히 감염병이 흔하고 심각한 자원이 제한된 지역[5]에서 신속하고 저렴하며 정확한 지역 진단과 응급 상황을 예측할 수 없는 광야 또는 전장에서의 치료가 필요합니다..의료 서비스가 제한적입니다[6].이러한 맥락에서 미세유체학은 정밀 유체 조작을 위한 미세전자기계 시스템 기술, 나노기술 또는 재료 과학을 결합한 기술이며[7,8,9,10], 현장 진단(POCT)에 대한 새로운 가능성을 제공합니다.) 병원 및 실험실 외부의 감염원.시간이 많이 소요되는 기존의 진단과 비교하여 미세 유체 기술은 질병 발생 시 분자 진단을 위한 샘플 및 비용 절감을 제공합니다.2019년 코로나바이러스 감염증(COVID-19)의 세계적 확산은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 의해 발생하고 있어, 전염병의 적시 예방과 통제를 위한 미세유체학의 중요성이 다시 강조되고 있다[11, 12 , 13].기존의 진단과 달리 미세유체 POCT는 벤치탑 분석기에서 작은 사이드스트림 테스트 스트립에 이르는 작은 휴대용 장치를 사용하여 샘플링 지점 근처에서 테스트합니다[14].이 테스트는 샘플 준비가 간단하거나 전혀 필요하지 않으며, 빠른 신호 증폭 및 민감한 신호 판독을 통해 짧은 기간과 몇 분 이내에 정확한 결과를 얻을 수 있습니다.미세유체 기반 의료 기기의 가용성과 대량 생산은 병원 외부, 환자 근처, 심지어 집에서도 비용 효율적이고 직접적인 진단 응용 프로그램을 확장했습니다.
기존의 감염병 진단 전략 중 분자진단은 가장 민감한 방법 중 하나이다[15, 16].또한 분자 진단은 종종 코로나19의 지속적인 탐지를 위한 금본위제로 사용되어 면역 반응이 시작되기 전에 RNA 또는 DNA의 바이러스 특정 영역을 직접 탐지할 수 있습니다[17, 18].현재 검토에서 우리는 학문적 관점에서 미래 산업적 관점에 이르기까지 감염성 질병에 대한 미세 유체 공학 기반 분자 진단 프로세스의 최신 발전을 제시합니다(그림 1).핵산 검출의 세 가지 핵심 단계인 온칩 샘플 전처리, 핵산 증폭 및 신호 판독부터 시작하겠습니다.그런 다음 서로 다른 유형의 미세 유체 플랫폼을 구조 및 기능과 비교하여 고유한 특성(강점 및 약점)을 보여줍니다.디지털 핵산 검출은 감염성 병원체 분자의 절대 정량화를 위한 3세대 기술의 예로 추가로 논의되고 제공됩니다.또한 분자 진단을 위한 미세유체 POCT 시장의 현황을 보여주기 위해 몇 가지 일반적인 최신 상용 POCT 장치를 선보일 예정입니다.우리는 또한 미래 응용 프로그램에 대한 우리의 비전을 논의하고 설명할 것입니다.
핵산 검출용 미세유체 칩의 모듈은 기능에 따라 3가지 범주(샘플링, 인식, 신호전달)로 나눌 수 있다[19].이 모듈 중 샘플링 모듈은 주로 샘플 용해 및 핵산 추출을 구현합니다.센서 모듈은 주로 핵산 신호의 변환 및 증폭을 제어합니다.시그널링 모듈은 센싱 모듈에서 변환 및 처리된 신호를 감지합니다.칩에서 핵산을 검출하는 과정을 바탕으로 '입출력' 기능을 구현할 수 있는 다양한 칩을 정리한다.
핵산 검출의 첫 번째 단계는 핵산 추출, 즉 원래 샘플에서 표적 핵산을 분리하는 것입니다.핵산 추출은 다른 분자 오염 물질로부터 핵산을 정제하고, 핵산 분자의 1차 구조의 무결성을 보장하고, 결과를 최적화하기 위해 수행됩니다.핵산 추출에는 필요한 시료 용해 및 핵산 캡처가 필요하며, 그 품질과 효율성은 연구 및 진단 결과에 큰 영향을 미칩니다.추출 중 미묘한 부작용으로 인해 추가 감지가 제한될 수 있습니다.예를 들어, 중합효소연쇄반응(PCR) 및 루프 등온 증폭(LAMP) 방법은 핵산 분리 시약의 에탄올 및 이소프로판올과 같은 일부 잔류 유기 용매에 의해 억제됩니다[20].액체-액체 추출과 고체상 추출은 핵산을 분리하는 가장 보편적인 방법이지만[21], 액체-액체 추출에 사용되는 시약은 대부분의 미세 유체 칩의 부식을 유발하기 때문에 칩에서 액체-액체 추출은 극히 제한적입니다. .여기에서는 마이크로어레이 기반 고체상 추출 방법을 강조하고 장점과 단점을 비교합니다.
실리콘은 생체 적합성, 안정성 및 변형 용이성으로 인해 핵산과 호환되는 기질 물질입니다[22].중요한 것은 실리카 또는 다른 물질로 변형될 때 이 복합재는 낮은 pH, 높은 염도 조건에서 음전하를 띤 핵산을 흡착하는 동시에 높은 pH, 낮은 염 용액으로 용리되는 특성을 나타낸다는 것입니다.이 현상을 바탕으로 핵산 정제가 가능하다.
실리카 비드, 분말, 마이크로파이버 필터, 실리카 멤브레인과 같은 다양한 형태의 실리카 기반 물질이 미세유체에서 핵산 추출에 사용되어 왔다[23, 24, 25, 26].재료의 특성에 따라 실리콘 기반 재료는 미세 회로에 다양한 방식으로 사용될 수 있습니다.예를 들어, 실리카 과립, 분말 및 상업용 나노 필터는 미세 유체 칩의 기공 또는 미세 채널에 간단히 배치할 수 있으며 샘플에서 핵산을 추출하는 데 도움이 됩니다[27, 28, 29].표면 개질된 실리카 멤브레인은 또한 저렴한 비용으로 병원체로부터 DNA를 신속하게 정제하는 데 사용할 수 있습니다.예를 들어, Wang et al.[30] 키토산 올리고당으로 코팅된 실리카 멤브레인과 소포 매개 사슬 교환과 변성 증폭 반응을 결합하여 102-108 집락 형성 단위를 성공적으로 감지하는 다목적 휴대용 시스템이 도입되었습니다.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., 그리고 바이러스의 존재를 쉽게 볼 수 있었습니다.Powell et al.그런 다음 실리콘 기반 마이크로어레이를 사용하여 C형 간염 바이러스(HCV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 지카 바이러스 및 인유두종 바이러스 및 자동 증식을 검출했으며, 여기서 RNA 바이러스를 포획하기 위해 1.3μl의 구불구불한 마이크로리액터가 개발되었습니다.현장 증폭을 수행합니다.이러한 방법 외에도 표면 개질된 실리카 마이크로컬럼은 변형 물질의 기하학적 구조와 특성이 추출 효율을 크게 증가시키기 때문에 핵산 추출에 중요한 역할을 합니다.Chen et al.[32]는 아미노 코팅된 실리콘 마이크로컬럼을 기반으로 하는 저농도 RNA의 분리를 위한 미세유체 플랫폼을 제안했습니다.이 미세 유체 장치는 실리콘 기판에 0.25cm2 미세 기둥 어레이를 통합하여 높은 표면적 대 부피 비율 설계를 통해 더 높은 추출 효율을 달성합니다.이 설계의 장점은 미세유체 장치가 최대 95%의 핵산 추출 효율을 달성할 수 있다는 것입니다.이러한 실리콘 기반 전략은 저렴한 비용으로 신속하게 핵산을 분리하는 가치를 보여줍니다.미세유체 칩과 결합하여 실리콘 기반 추출 전략은 핵산 검출의 효율성을 높일 뿐만 아니라 분석 장치의 소형화 및 통합을 촉진할 수 있습니다[20].
자기 분리 방법은 외부 자기장이 있는 상태에서 자기 입자를 사용하여 핵산을 분리합니다.일반적으로 사용되는 자성 입자는 실리카, 아미노 및 카르복실로 코팅된 Fe3O4 또는 γ-Fe2O3 자성 입자를 포함합니다[33,34,35,36].실리콘 기반의 SPE 방식에 비해 자성입자의 특징은 외부 자석으로 조작 및 제어가 용이하다는 점이다.
핵산과 실리카의 정전기적 상호작용을 이용하여 염도가 높고 pH가 낮은 조건에서는 실리카가 코팅된 자성입자 표면에 핵산이 흡착되고 염도가 높고 pH가 높은 조건에서는 분자를 세척할 수 있습니다. 다시..실리카 코팅된 자기 비드를 사용하면 자기 제어 동작을 사용하여 대용량 샘플(400μL)에서 DNA를 추출할 수 있습니다[37].데모로서 Rodriguez-Mateos et al.[38]은 자기 비드가 다른 챔버로 이동하는 것을 제어하기 위해 조정 가능한 자석을 사용했습니다.실리카 코팅된 자성 입자를 기반으로 LAMP 역전사 검출(RT-LAMP)을 위해 폐수 샘플에서 470 사본/mL의 SARS-CoV-2 게놈 RNA를 추출할 수 있으며 응답을 1시간 이내에 읽을 수 있습니다.육안(그림 2a).
자성 및 다공성 재료 기반 장치.SARS-CoV-2 RNA 검출을 위한 IFAST RT-LAMP 미세유체 장치의 개념도([38]에서 수정).b 협측 면봉 핵산의 dSPE용 원심 마이크로 장치([39]에서 수정).c FTA® 카드를 사용하는 내장형 자체 전원 샘플 농축기([50]에서 수정).d 키토산으로 변형된 Fusion 5 여과지([51]에서 수정).SARS-CoV-2 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2, RT-LAMP 역전사 루프 매개 등온 증폭, FTA 파인더 기술 파트너, NA 핵산
양전하를 띤 자성 입자는 핵산의 인산 골격을 부착하는 데 이상적입니다.특정 염 농도에서 핵산의 음으로 하전된 인산염 그룹은 자성 복합 입자 표면에서 양으로 하전될 수 있습니다.따라서 핵산 추출을 위해 표면이 거칠고 아미노기 밀도가 높은 자성 나노 입자가 개발되었습니다.자기 분리 및 차단 후 자기 나노 입자 및 DNA 복합체를 PCR에 직접 사용할 수 있으므로 복잡하고 시간이 많이 소요되는 정제 및 용출 작업이 필요하지 않습니다[35].음의 카르복실기로 코팅된 자성 나노입자는 고농도 폴리에틸렌 글리콜과 염화나트륨 용액에서 표면에 흡착된 핵산을 분리하는 데에도 사용되었습니다[36].이러한 표면 수정된 자기 비드를 사용하면 DNA 추출이 후속 증폭과 호환됩니다.Dignan et al.[39]는 비기술 인력이 현장에서 이를 사용할 수 있도록 하는 핵산 전처리를 위한 자동화된 휴대용 원심 미세유체 플랫폼을 설명했습니다.또한, 현장 진단 핵산 분석에 적합한 방법인 LAMP와 분리된 DNA의 호환성은 최소한의 장비 요구 사항과 비색 분석에 대한 적합성을 추가로 보여줍니다(그림 2b).
마그네틱 비드 방법은 자동화 추출 가능성을 제공하며 그 중 일부는 상업용 자동화 핵산 추출기에 존재합니다[KingFisher;ThermoFisher(미국 매사추세츠주 월섬), QIAcube® HT;CapitalBio(중국 베이징) 및 Biomek®;베크만(미국 마이애미).), 플로리다, 미국)].자기 비드를 미세 유체와 결합하는 이점은 핵산의 효율적인 자동 추출에 사용될 수 있으며, 이는 분자 진단의 개발을 잠재적으로 발전시킬 수 있습니다.그러나 자성 비드와 미세 유체의 조합은 여전히 ​​자성 비드의 정확한 조작을 위한 복잡한 제어 시스템에 크게 의존하며, 이는 상용 제품이 부피가 크고 비싸다는 인기를 설명하며, 이는 POCT에서 자성 비드의 추가 적용을 제한합니다.
변형된 니트로셀룰로오스 필터, Finders Technology Associates(FTA) 카드, 폴리에테르설폰 기반 여과지 및 글리칸 코팅 재료와 같은 여러 다공성 재료도 핵산 검출에 사용되었습니다[40, 41, 42, 43, 44].섬유 종이와 같은 다공성 섬유 물질은 긴 가닥 DNA 분자를 섬유와 물리적으로 엉킴으로써 DNA를 분리하는 데 처음 사용되었습니다.작은 기공은 DNA 분자의 강력한 물리적 제한으로 이어져 DNA 추출에 긍정적인 영향을 미칩니다.섬유질 종이의 기공 크기가 다르기 때문에 추출 효율이 DNA 증폭의 요구 사항을 충족할 수 없습니다[45, 46].FTA 카드는 법의학 분야에서 사용되는 상업용 여과지이며 분자 진단의 다른 영역에서 널리 사용됩니다.다양한 화학 물질을 함침시킨 셀룰로오스 여과지를 사용하여 시료의 세포막을 용해함으로써 방출된 DNA를 최대 2년 동안 분해로부터 보호합니다.보다 최근에는 SARS-CoV-2, 리슈만편모충증 및 말라리아를 포함한 다양한 병원체의 분자 검출을 위해 함침 셀룰로오스 종이가 개발되었습니다[47,48,49].분리된 혈장의 HIV는 직접 용해되고 바이러스 핵산은 농축기에 내장된 FTA® 유동막에 농축되어 핵산을 효율적으로 생산할 수 있습니다[50](그림 2c).FTA 카드를 사용한 핵산 검출의 주요 문제는 구아니딘 및 이소프로판올과 같은 화학 물질이 후속 증폭 반응을 억제한다는 것입니다.이 문제를 해결하기 위해 우리는 DNA 분자와 섬유상 여과지의 물리적 인터레이싱과 키토산 변형 화합물에 대한 DNA의 정전기 흡착의 장점을 결합하여 고효율 핵산 추출을 달성하는 Fusion 5 키토산 변형 여과지를 개발했습니다. ..필터 섬유 [51] (그림 2d).유사하게, Zhu et al.[52]는 Zika 바이러스 RNA의 신속한 분리 및 검출을 위한 in situ 모세관 미세유체 시스템을 기반으로 하는 키토산 변형 PCR 방법을 시연했습니다.핵산은 키토산의 on/off 스위치 특성에 따라 혼합 용해물/PCR 배지에서 각각 흡착/탈착될 수 있습니다.온 및 오프", pH에 반응합니다.
위에서 언급한 바와 같이, 이러한 전략은 다양한 고체상 물질의 장점을 결합하고 미세 유체에서 핵산 추출의 효율성을 증가시킵니다.실제 적용에서 이러한 재료를 대량으로 사용하는 것은 비경제적이며 이러한 재료로 일반적인 재료의 적절한 표면 처리 또는 표면 개질도 기능을 보존할 수 있습니다.따라서 파일럿 연구 후 이러한 전략을 구현하면 비용을 줄일 수 있다고 믿어집니다.
미세유체 플랫폼에서 핵산 테스트는 종종 적은 양의 샘플(< 100 µl)을 사용하므로 다운스트림 검출(광학, 전기 및 자기)에 편리한 신호로 변환하기 위해 특정 프로브로 표적 핵산을 증폭해야 합니다[53, 54]. 미세유체 플랫폼에서 핵산 테스트는 종종 적은 양의 샘플(< 100 µl)을 사용하므로 다운스트림 검출(광학, 전기 및 자기)에 편리한 신호로 변환하기 위해 특정 프로브로 표적 핵산을 증폭해야 합니다[53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Microfluidic 플랫폼에서 핵산을 검사할 때 소량(<100 µL)의 시료를 사용하는 경우가 많으므로 표적 핵산을 후속 검출(광학, 전기, 자기)에 편리한 신호로 변환하기 위해 특수 프로브를 사용하여 표적 핵산을 증폭해야 합니다. [53, 54].微流控 微流控 上 上 平台 核酸 检测 检测 通常 使用 小样本量 小样本量 (<100 µl), 因此 需要 需要 需要 使用 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 核酸 核酸 核酸 核酸 以 转换 转换 为 便于 下游 检测 检测 (光学 、 、 电学 和 和）) 的 信号 [53, 54 ]。微流控 微流控 微流控 上 平台 核酸 核酸 检测 使用 小样本量 小样本量 小样本量 小样本量 (<100 µl), 因此 需要 需要 需要 特定 探针 扩增 目标 目标 目标 以 为 为 下游 下游 下游 下游 下游 (光学 、 电学 磁学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. 미세유체 플랫폼에서 핵산 검출은 일반적으로 소량의 샘플(<100μl)을 사용하며, 이를 위해 특수 프로브로 표적 핵산을 증폭하여 후속 검출(광학, 전기 및 자기)을 위한 신호로 변환해야 합니다[53, 54]] .미세 유체 공학에서 핵산 증폭은 또한 반응 속도를 높이고 검출 한계를 최적화하며 샘플 요구 사항을 줄이고 검출 정확도를 향상시킬 수 있습니다[55, 56].최근 몇 년 동안 빠르고 정확한 검출이 실현되면서 PCR 및 일부 등온 증폭 반응을 비롯한 다양한 핵산 증폭 방법이 미세 유체에 적용되었습니다.이 섹션에서는 미세유체 시스템을 기반으로 하는 핵산 검출 방법을 요약합니다.
PCR은 유기체의 DNA 복제 과정에 대한 시뮬레이션이며 이론은 다른 곳에서 자세히 설명되어 있으므로 여기에서 논의하지 않습니다.PCR은 매우 적은 양의 표적 DNA/RNA를 기하급수적인 속도로 증폭할 수 있으므로 PCR은 핵산의 신속한 검출을 위한 강력한 도구입니다.최근 수십 년 동안 PCR 열 순환 시스템이 장착된 많은 휴대용 미세유체 장치가 현장 진단의 요구를 충족하기 위해 개발되었습니다[57, 58].온칩 PCR은 온도 조절 방식에 따라 4가지 유형(conventional, continuous flow, spatially controlled, convective PCR)으로 나눌 수 있다[59].예를 들어, Gee et al.[60]은 인후 면봉 샘플에서 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 다중 검출을 위한 자체 미세유체 플랫폼에서 직접 역전사 정량적 PCR(RT-qPCR) 방법을 개발했습니다(그림 3a).Parket al.[61]은 박막 PCR, 전극 및 손가락으로 작동되는 폴리디메틸실록산 기반 미세유체 모듈을 통합하여 간단한 병원체 분석 칩을 구축했습니다.그러나 두 작업 모두 기존 PCR의 공통된 단점을 구현합니다.PCR에는 열 순환이 필요하므로 추가 장치 소형화 및 테스트 시간 단축을 제한합니다.
연속 흐름 기반 미세 유체 및 공간 전환 PCR의 개발은 이 문제를 해결하는 데 중요합니다.긴 구불구불한 채널 또는 짧은 직선 채널을 사용하는 연속 흐름 PCR은 오프칩 펌프로 3개의 예열 영역에서 시약을 활발하게 순환시켜 빠른 증폭을 제공할 수 있습니다.이 작업은 서로 다른 반응 온도 사이의 전환 단계를 성공적으로 방지하므로 테스트 시간이 크게 단축됩니다[62](그림 3b).Jung et al.의 또 다른 연구에서.[63]은 초고속 및 다중 역전사 PCR을 위해 고정 및 유동 PCR의 특성을 결합한 새로운 회전식 PCR 유전자 분석기를 제안했습니다(그림 3c).핵산 증폭을 위해 PCR 마이크로칩은 서로 다른 온도에서 3개의 가열 블록을 통해 회전됩니다. 1. Denaturation 블록 94°C, 2. Annealing 블록 58°C, 3. Expansion 블록 72°C.
미세 유체 공학에서 PCR의 응용.미세 유체 플랫폼에서 dirRT-qPCR의 도식 표현([60]에서 수정).b 구불구불한 채널을 기반으로 하는 연속 흐름 PCR 마이크로어레이의 개략도([62]에서 수정).c 마이크로칩, 3개의 가열 블록 및 스테퍼 모터로 구성된 회전식 PCR 유전자 분석기의 개략도([63]에서 수정).d 원심분리 및 설정이 포함된 열대류 PCR의 다이어그램([64]에서 수정).DirRT-qPCR, 직접 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응
모세관과 루프 또는 얇은 판을 사용하는 대류 PCR은 외부 펌프 없이도 자연적인 자유 열 대류에 의해 핵산을 빠르게 증폭할 수 있습니다.예를 들어, 고리형 올레핀 폴리머 미세유체 플랫폼은 PCR 루프 마이크로채널에서 원심분리와 함께 열 순환을 사용하는 제작된 회전 가열 단계에서 개발되었습니다[64](그림 3d).반응 용액은 환형 구조의 마이크로 채널에서 고온과 저온을 지속적으로 교환하는 열 대류에 의해 구동됩니다.전체 증폭 과정은 70.5pg/채널의 검출 한계로 10분 안에 완료될 수 있습니다.
예상대로 Rapid PCR은 완전히 통합된 샘플 반응 분자 진단 및 다중 분석 시스템을 위한 강력한 도구입니다.Rapid PCR은 SARS-CoV-2를 감지하는 데 필요한 시간을 크게 줄여 코로나19 대유행을 효과적으로 통제하는 데 기여합니다.
PCR에는 POCT에 적합하지 않은 복잡한 열 순환 장치가 필요합니다.보다 최근에는 LAMP, RPA(recombinase polymerase amplification) 및 핵산 서열 기반 증폭을 포함하지만 이에 국한되지 않는 등온 증폭 기술이 미세유체에 적용되었습니다[65,66,67,68].이러한 기술을 통해 핵산은 일정한 온도에서 증폭되어 분자 진단을 위한 저가의 고감도 휴대용 POCT 장치를 쉽게 만들 수 있습니다.
고처리량 미세유체 기반 LAMP 분석은 감염성 질병의 다중 검출을 가능하게 합니다[42, 69, 70, 71].원심 미세유체 시스템과 결합하여 LAMP는 핵산 검출의 자동화를 더욱 촉진할 수 있습니다[69, 72, 73, 74, 75].스핀 및 반응 SlipChip은 LAMP를 사용하여 여러 병렬 박테리아의 시각적 검출을 위해 개발되었습니다[76](그림 4a).분석에 최적화된 LAMP를 사용할 때 형광 신호 대 잡음비는 약 5배였으며 검출 한계는 게놈 DNA의 7.2 사본/μl에 도달했습니다. 또한, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis 및 Vibrio parahaemolyticus를 포함한 5가지 일반적인 소화 박테리아 병원체의 존재를 < 60분 만에 방법을 기반으로 시각화했습니다. 또한, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis 및 Vibrio parahaemolyticus를 포함한 5가지 일반적인 소화 박테리아 병원체의 존재를 < 60분 만에 방법을 기반으로 시각화했습니다.또한, 이 방법을 사용하여 Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis 및 Vibrio parahaemolyticus를 포함한 소화관의 5가지 일반적인 박테리아 병원체의 존재를 시각화했습니다.此外 此外, 基于 ， 方法 方法 <60 分钟 分钟 内 可 可 视化 了 五 种 种 常见 消化道 消化道 细菌病 原体 的 存在 存在 存在 存在 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 、 大 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 氏 菌 、 河流 弧菌 和 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 河流此外 此外, 基于 ， 方法 方法 <60 分钟 分钟 内 视化 视化 了 五 种 种 常见 消化道 消化道 细菌病 的 存在 存在 存在 存在 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 肠 氏 菌 菌 、 弧菌 和 副溶血 性 。。。 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIP또한 이 방법을 사용하여 Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius 및 Vibrio parahaemolyticus를 포함한 5가지 일반적인 세균성 위장 병원균의 존재를 시각화했습니다.
미세유체학에서 LAMP의 장점은 무엇보다도 빠른 응답과 소형화된 감지를 포함합니다.그러나, 반응 온도(약 70°C)로 인해 LAMP 동안 필연적으로 에어로졸이 생성되어 높은 위양성률이 발생합니다.분석 특이성, 프라이머 디자인 및 온도 제어도 LAMP에 최적화되어야 합니다.또한 단일 칩에서 다중 표적 탐지를 구현하는 칩 설계는 가치가 높으므로 개발해야 합니다.또한 LAMP는 하나의 칩에 집적된 다목적 검출에 적합하다는 점이 매우 중요하지만 아직 개발의 여지가 많다.
상대적으로 낮은 반응 온도(~37°C)로 인해 증발 문제가 상대적으로 적기 때문에 LAMP의 높은 위양성 비율은 RPA로 부분적으로 줄일 수 있습니다[77].RPA 시스템에서 두 개의 반대 프라이머는 recombinase에 결합하여 DNA 합성을 시작하고 10분 이내에 증폭을 완료할 수 있습니다[78,79,80,81].따라서 전체 RPA 프로세스는 PCR 또는 LAMP보다 훨씬 빠릅니다.최근 몇 년 동안 미세 유체 기술은 RPA의 속도와 정확도를 더욱 향상시키는 것으로 나타났습니다[82,83,84].예를 들어, Liu et al.[85]는 역전사 RPA(RT-RPA)와 보편적인 측면 흐름 검사 스트립 검출 시스템을 통합하여 SARS-CoV-2의 빠르고 민감한 검출을 위한 미세유체 통합 측면 흐름 중합효소 재조합효소 증폭 분석을 개발했습니다.단일 미세 유체 시스템으로.그림 4b).검출한도는 1copy/μl 또는 30copy/sample이며 약 30분 이내에 검출을 완료할 수 있습니다.Konget al.웨어러블 미세유체 장치를 개발했습니다.[86] 체온과 휴대폰 기반 형광 검출 시스템을 사용하여 RPA를 사용하여 HIV-1 DNA를 신속하고 직접적으로 검출했습니다(그림 4c).웨어러블 RPA 분석은 24분 이내에 표적 서열의 100카피/mL를 감지하여 리소스가 제한된 환경에서 HIV-1에 감염된 유아를 신속하게 진단할 수 있는 큰 잠재력을 보여줍니다.
현장 진단 테스트(POCT)의 등온 증폭.스핀과 반응 슬립칩의 개발 및 생산.플라즈마 용접 후 상단 및 하단 칩을 너트 세트로 조립하여 최종 칩을 형성했습니다([76]에서 채택).b COVID-19 감지를 위한 MI-IF-RPA 시스템의 개략도([85]에서 수정).c HIV-1 DNA의 신속한 검출을 위한 웨어러블 RPA 테스트의 개략도([86]에서 수정).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, 인간 면역결핍 바이러스 HIV, RPA 재조합효소 중합효소 증폭, LED 발광 다이오드, MI-IF-RPA Microfluidics Recombinase Integrated Lateral Polymerase 확대
미세유체 기반 RPA는 빠르게 발전하고 있지만 칩 제조 비용과 반응 소비가 너무 높기 때문에 이 기술의 가용성을 높이려면 줄여야 합니다.또한 RPA의 높은 감도는 특히 오염이 있는 경우 비특이적 제품의 증폭에 영향을 줄 수 있습니다.이러한 제한은 미세 유체 시스템에서 RPA의 적용에 영향을 미칠 수 있으며 추가 최적화가 필요합니다.POCT에서 RPA 기반 미세 유체 전략의 실행 가능성을 향상시키기 위해서는 다양한 표적에 대해 잘 설계된 프라이머와 프로브가 필요합니다.
Cas13과 Cas12a는 핵산을 무작위로 절단하는 능력이 있어 검출 및 진단 도구로 개발될 수 있습니다.Cas13과 Cas12a는 각각 표적 DNA 또는 RNA에 결합할 때 활성화됩니다.일단 활성화되면, 단백질은 근처에 있는 다른 핵산을 절단하기 시작하고, 그 후 병원체 특이적 핵산을 표적으로 하는 가이드 RNA는 소광된 형광 프로브를 절단하고 형광을 방출할 수 있습니다.이 이론을 바탕으로 Kellner et al.[87]은 Cas13 기반 방법[특정 고감도 효소 보고자 잠금 해제(SHERLOCK)] 및 Broughton et al.[88]은 Cas12a[CRISPR Trans Reporter 표적화 DNA 엔도뉴클레아제(DTECR)]에 기반한 또 다른 접근 방식을 개발했습니다.
최근에는 CRISPR 기반의 핵산 검출을 위한 다양한 방법이 등장하고 있다[89, 90].기존의 CRISPR 기반 방법은 핵산 추출, 증폭 및 CRISPR 검출을 포함한 여러 절차로 인해 시간과 노동 집약적인 경우가 많습니다.액체가 공기에 노출되면 위양성 결과가 나올 가능성이 높아집니다.위의 내용을 감안할 때 CRISPR 기반 시스템은 최적화가 절실히 필요합니다.
CRISPR-Cas12a 및 CRISPR-Cas13a 검출 애플리케이션을 위해 24개의 분석을 병렬로 수행할 수 있는 공압 제어 미세유체 플랫폼이 개발되었습니다[91].이 시스템에는 핵산 증폭을 우회하고 femtomolar DNA 및 RNA 샘플을 자동으로 검출하는 형광 검출 장치가 장착되어 있습니다.Chen et al.원심 미세 유체에서 CRISPR-Cas12a 시스템과 통합된 재조합 효소 증폭(그림 5a).이 작업은 Cas12a가 메신저 DNA를 소화하고 증폭 과정을 억제할 수 있기 때문에 이 두 과정을 통합하는 어려움을 극복합니다.또한 Chen et al.추가로 반응 시약을 원심 미세유체 제어 장치에 미리 저장하여 전체 공정을 자동으로 완료했습니다.다른 연구에서 Silva et al.[93]은 CRISPR/Cas12a 증폭이 없는 진단 방법과 SARS-CoV-2를 감지하는 스마트폰을 개발했습니다(그림 5b).휴대 전화 기반 증폭이 필요 없는 시스템으로 알려진 이 분석에는 미세 유체 채널에서 카탈라아제 생성 거품 신호의 스마트폰 시각화를 기반으로 하는 CRISPR/Cas 종속 효소가 포함됩니다.사전 증폭 없이 50 copy/µl 미만의 핵산을 민감하게 검출하므로 샘플 주입에서 신호 판독까지의 전 과정이 단 71분이 소요됩니다.
CRISPR에 기반한 핵산 검출 방법.CRISPR에 기반한 통합 분자 진단을 위한 원심 POCT([92]에서 수정).b 스마트폰 기반 SARS-CoV-2 분석을 위한 CASCADE 테스트 개발([93]에서 수정).RAA 재조합효소 증폭, PAM 인접 프로토스페이서 모티프, CRISPR 클러스터링된 짧은 회문 규칙적 간격, CRISPR/CAS 의존성 효소를 사용한 휴대전화 증폭 없는 CASCADE 시스템, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염 EDC
핵산 검출의 마지막 단계인 신호 검출은 진단 결과를 직접 반영하며 효율적이고 민감하며 정확한 POCT 개발에 중요한 요소입니다.신호는 형광, 전기화학, 비색 및 자기 전략과 같은 다양한 방법을 사용하여 읽을 수 있습니다.이 섹션에서는 각 접근 방식에 대한 이론적 근거를 설명하고 미세유체학에서 전염병의 분자 진단을 비교합니다.
형광 기반 전략은 우수한 민감도, 저렴한 비용, 조작 용이성 및 현장 진단 분석이라는 놀라운 장점으로 인해 감염성 질환의 POCT 진단에 널리 사용됩니다[94, 95].이러한 전략은 형광 염료 및 나노물질과 같은 표지된 형광단을 사용하여 감지 가능한 신호(형광 향상 또는 소광)를 생성합니다.이 발견은 형광 기반 전략이 직접 형광 표지, 신호 켜짐 및 신호 꺼짐 형광 검출로 나눌 수 있음을 시사합니다[96].직접 형광 표지 검출은 표적에 선택적으로 결합될 때 특정 양의 형광을 생성하는 특정 리간드를 표지하기 위해 특수 형광 표지를 사용합니다.신호 기반 형광 검출의 경우 형광 신호의 품질은 관심의 크기와 양의 관계가 있습니다.형광 강도는 표적이 없을 때 무시할 수 있고 충분한 양의 표적이 있을 때 감지할 수 있습니다.반대로, "signal-off" 형광에 의해 검출되는 형광의 강도는 타겟의 양에 반비례하며, 처음에는 최대값에 도달하고 타겟이 확대됨에 따라 점차 감소합니다.예를 들어, CRISPR-Cas13a 표적 의존성 트랜스 절단 메커니즘을 사용하여 Tian et al.[97]은 역전사를 직접 우회하는 RNA를 감지하는 새로운 인식 전략을 개발했습니다(그림 6a).상보적 표적 RNA에 결합하면 CRISPR-Cas13-RNA 복합체가 활성화되어 비특이적 리포터 RNA에 의한 측부 절단을 촉발할 수 있습니다.형광 표지된 리포터[형광단(F)]는 소광제(Q)에 의해 온전하고 활성화된 복합체에 의해 절단될 때 형광을 발합니다.
전기 화학 검출의 장점은 높은 검출 속도, 쉬운 생산, 저렴한 비용, 휴대하기 쉽고 자동 제어입니다.POCT 응용 프로그램을 위한 강력한 분석 방법입니다.그래핀 전계 효과 트랜지스터 기반 Gao et al.[98]은 2 pg/mL의 검출 한계로 Borrelia burgdorferi 박테리아에서 라임병 항원의 다중 검출을 위한 나노바이오센서를 개발했습니다(그림 6b).
비색 분석은 휴대성, 저렴한 비용, 준비 용이성 및 시각적 판독의 이점을 통해 POCT 응용 분야에 사용되었습니다.비색 검출은 과산화효소 또는 과산화효소 유사 나노물질의 산화, 나노물질의 응집, 지시 염료의 추가를 사용하여 표적 핵산의 존재에 대한 정보를 가시적인 색상 변화로 변환할 수 있습니다[99, 100, 101].특히, 금 나노입자는 비색 전략 개발에 널리 사용되며, 신속하고 현저한 색상 변화를 유도하는 능력으로 인해 감염성 질병의 현장 진단을 위한 POCT 비색 플랫폼 개발에 대한 관심이 증가하고 있습니다[102].통합된 원심 미세유체 장치[103]를 사용하면 오염된 우유 샘플의 식인성 병원체를 10개의 박테리아 세포 수준에서 자동으로 감지할 수 있으며 결과를 65분 이내에 시각적으로 읽을 수 있습니다(그림 6c).
자기 감지 기술은 자성 물질을 사용하여 분석 물질을 정확하게 감지할 수 있으며 최근 수십 년 동안 POCT 응용 분야에 상당한 관심이 있었습니다.자기 감지 기술은 값비싼 광학 부품보다 저렴한 자기 재료와 같은 몇 가지 고유한 장점이 있습니다.그러나 자기장을 사용하면 검출 효율이 향상되고 시료 준비 시간이 단축됩니다[104].또한, 자기 프로브의 결과는 생물학적 시료의 미미한 자기 배경 신호로 인해 높은 특이성, 감도 및 높은 신호 대 잡음비를 보여줍니다[105].Sharma et al.자기 터널 접합 기반 바이오센서를 휴대용 마이크로칩 플랫폼에 통합했습니다.병원체의 다중 검출을 위해(도 6d).바이오센서는 병원체에서 분리된 서브나노몰 핵산을 민감하게 감지합니다.
일반적인 신호 감지 방법.Cas13a의 초국소화 탐지 개념([97]에서 수정).b Lyme GroES scFv와 결합된 그래핀 나노바이오센서 FET([98]에서 수정).c 원심 미세유체 칩에서 식품 매개 병원체의 다중 검출을 위한 비색 표시: 표적 병원체가 있는 1번 및 3번 샘플, 표적 병원체가 없는 2번, 4번 및 5번 샘플([103]에서 수정) .d 플랫폼, 내장형 차단 증폭기, 제어 장치 및 신호 생성/획득을 위한 전원 공급 장치를 포함하는 자기 터널 접합에 기반한 바이오센서([106]에서 채택).GFET 그래핀 FET, 대장균, 대장균, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethyl methacrylate
상기 검출 방법의 우수한 특성에도 불구하고 여전히 단점이 있다.세부 사항(장단점)이 있는 일부 응용 프로그램을 포함하여 이러한 방법을 비교합니다(표 1).
미세유체학, 미세전자기계 시스템, 나노기술 및 재료과학의 발달로 감염성 질병 검출을 위한 미세유체 칩의 사용이 지속적으로 발전하고 있다[55,96,107,108].소형 장비 및 유체의 정확한 조작은 진단 정확도와 비용 효율성에 기여합니다.따라서 추가 개발을 위해 칩을 최적화하고 업그레이드하려는 노력이 있어 구조와 기능이 다른 다양한 미세 유체 칩이 생성됩니다.여기에서는 몇 가지 일반적인 유형의 미세 유체 플랫폼을 간략하게 소개하고 그 특성(장단점)을 비교합니다.또한 아래 나열된 대부분의 예는 주로 SARS-CoV-2 퇴치에 중점을 둡니다.
LOCC는 가장 일반적인 소형화 복합 분석 시스템이며 그 작업은 시료 주입 및 준비, 흐름 제어 및 액체 감지에서 고도로 소형화, 통합, 자동화 및 병렬화됩니다[109, 110].액체는 신중하게 설계된 기하학적 구조와 압력 구배, 모세관 작용, 전기역학, 자기장 및 음파와 같은 많은 물리적 효과의 상호 작용을 통해 조작됩니다[111].LOCC는 빠른 분석 속도, 작은 샘플 크기, 낮은 전력 소비, 높은 관리 및 운영 효율성으로 높은 처리량 스크리닝 및 다중 탐지에서 탁월한 이점을 보여줍니다.그러나 LOCC 장치는 매우 섬세하고 제조, 포장 및 인터페이스합니다.그러나 다중화와 재사용은 엄청난 어려움에 직면해 있다[96].다른 플랫폼과 비교할 때 LOCC는 최대 응용 프로그램 다양성과 최고의 기술 호환성 측면에서 고유한 장점이 있지만 단점도 분명합니다. 즉, 높은 복잡성과 낮은 반복성입니다.종종 부피가 크고 값비싼 외부 펌프에 대한 의존도는 POCT에서의 사용을 더욱 제한합니다.
COVID-19 발생 당시 LOCC는 많은 관심을 받았습니다.동시에 여러 기술을 결합한 몇 가지 새로운 칩이 있습니다.예를 들어, 스마트폰은 이제 휴대용 분석 장치로 널리 사용되며 LOCC 통합에 대한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.Sun et al.SARS-CoV-2 등 5개 병원체의 특정 핵산서열을 LAMP를 이용해 다중화할 수 있는 미세유체칩을 제작해 반응 종료 후 1시간 이내에 스마트폰으로 분석했다.또 다른 예로서, Sundah et al.[112]는 스마트폰을 사용하여 SARS-CoV-2 RNA 표적의 직접적이고 민감한 검출을 위한 분자 스위치[분자 전이 상태 스위치(CATCH)에 의한 촉매 증폭]를 만들었습니다. CATCH는 휴대용 LOCC와 호환되며 우수한 성능을 달성합니다(약 8 RNA 사본/μl, 실온에서 < 1시간) [112]. CATCH는 휴대용 LOCC와 호환되며 우수한 성능을 달성합니다(약 8 RNA 사본/μl, 실온에서 < 1시간) [112]. [CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 клокпий Рность) CATCH는 휴대용 LOCC와 호환되며 우수한 처리량을 제공합니다(약 8 RNA 사본/µl, 실온에서 < 1시간) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能(大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时)[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能(大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时)[112]。 [CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностанью (примерно 8 кокм/1 Р) CATCH는 휴대용 LOCC와 호환되며 성능이 뛰어납니다(약 8 RNA 사본/µl, 실온에서 < 1시간)[112].또한 분자 진단용 LOCC 장치는 진공, 신축 및 전기장과 같은 일부 구동력도 사용합니다.Kanget al.[113]은 진공 플라즈몬 액체 PCR 칩을 사용하여 현장에서 코로나19의 신속하고 정량적인 진단을 위한 실시간 초고속 나노플라즈마 온어칩 PCR을 시연했다.Li et al.[114] 이후에 COVID-19 진단을 가능하게 하는 스트레치 구동 미세유체 칩을 개발했습니다.플랫폼은 RT-LAMP 증폭 시스템을 사용하여 샘플이 정성적으로 양성인지 음성인지 결정합니다.그 후, Ramachandran et al.[115] 미세 유체 공학에서 구현되는 선택적 이온 집속 기술인 ITP(isotachophoresis)를 사용하여 적절한 전기장 구배를 달성했습니다.ITP를 사용하면 원시 비인두 면봉 샘플의 표적 RNA를 자동으로 정제할 수 있습니다.그런 다음 Ramachandran et al.이 ITP 정제를 ITP 강화 LAMP 및 CRISPR 분석과 결합하면 약 35분 만에 인간 비인두 면봉 및 임상 표본에서 SARS-CoV-2를 검출했습니다.또한 새로운 아이디어가 끊임없이 등장합니다.Jadhav et al.[116]은 수직으로 배향된 금/은 코팅 탄소 나노튜브 또는 일회용 전기방사 마이크로/나노튜브를 포함하는 미세유체 장치와 결합된 표면 강화 라만 분광법에 기반한 진단 체계를 제안했습니다.멤브레인 기능을 갖춘 내장 필터 마이크로채널은 일회용입니다.이 장치는 타액, 비인두 및 눈물과 같은 다양한 체액/삼출물에서 바이러스를 흡착합니다.따라서 바이러스 역가가 풍부하고 라만 서명으로 바이러스를 정확하게 식별할 수 있습니다.
LOAD는 모든 공정이 미세구조 기판을 회전시키는 주파수 프로토콜에 의해 제어되는 원심 미세유체 플랫폼입니다[110].LOAD 장치는 원심력을 중요한 구동력으로 사용하는 것이 특징입니다.액체는 또한 모세관, 오일러 및 코리올리 힘의 영향을 받습니다.원심 분리기 장치를 사용하여 방사형 내부에서 외부 위치로 연속 액체 작동으로 분석이 수행되므로 추가 외부 튜브, 펌프, 액추에이터 및 활성 밸브가 필요하지 않습니다.요컨대, 단일 제어 방법은 작업을 단순화합니다.부하 중심에서 같은 거리에 있는 같은 미세유체 채널의 액체에 작용하는 힘은 동일하므로 채널 구조를 반복할 수 있습니다.따라서 LOAD 장비는 기존 LOCC 장비보다 설계 및 제조가 더 간단하고 경제적인 반면 반응은 대체로 독립적이고 병렬화됩니다.그러나 원심 장비의 높은 기계적 강도로 인해 사용 가능한 칩 재료가 제한되고 소량이 어렵습니다.차에.동시에 대부분의 LOAD 장치는 1회용으로만 설계되어 대규모 감지에 비용이 많이 듭니다[96, 117, 118, 119].
최근 수십 년 동안 가장 유망한 미세 유체 장치 중 하나로 간주되는 LOAD는 연구자와 제조업체로부터 상당한 관심을 받았습니다.따라서 LOAD는 특히 COVID-19 발생 동안 감염성 병원체[120, 121, 122, 123, 124]의 분자 진단에 널리 수용되고 사용되었습니다.예를 들어, 2020년 말에 Ji et al.[60]은 인후 면봉 표본에서 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A 및 B 감염의 신속하고 자동화된 병렬 검출을 위한 직접적인 RT-qPCR 분석을 시연했습니다.그런 다음 Xiong et al.[74]는 SARS-CoV-2를 포함한 7가지 인간 호흡기 코로나바이러스를 40분 이내에 신속하고 정확하며 동시적으로 검출할 수 있는 LAMP 통합 원판형 미세유체 플랫폼을 제시했습니다.2021년 초에 de Oliveira et al.[73]은 COVID-19의 RT-LAMP 분자 진단을 위해 손가락 끝 회전기로 수동으로 작동되는 폴리스티렌 토너 원심 미세 유체 칩을 시연했습니다.그 후, Dignan et al.[39]는 협측 면봉 절편에서 직접 SARS-CoV-2 RNA를 정제하기 위한 자동 휴대용 원심분리기 마이크로장치를 제시했습니다.Medved et al.[53]은 검출 한계가 10copy/μL이고 최소 주기 임계값이 15분인 소량 회전 미세유체 형광 칩이 있는 인라인 SARS-CoV-2 에어로졸 샘플링 시스템을 제안했습니다.Suarez et al.[75] 최근 LAMP를 사용하여 열 비활성화 비인두 면봉 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 직접 검출하기 위한 통합 모듈식 원심 미세유체 플랫폼의 개발을 보고했습니다.이 예는 COVID-19의 분자 진단에서 LOAD의 큰 이점과 가능성을 보여줍니다.
1945년 Muller와 Clegg[125]는 여과지와 파라핀을 사용하여 종이에 미세유체 채널을 처음 제시했습니다.2007년 Whitesides 그룹[126]은 단백질 및 포도당 테스트를 위한 최초의 기능성 종이 플랫폼을 만들었습니다.종이는 미세유체학에 이상적인 기판이 되었습니다.종이는 친수성 및 다공성 구조, 우수한 생체 적합성, 경량, 유연성, 접힘성, 저렴한 비용, 사용 용이성 및 편의성과 같은 고유한 특성을 가지고 있습니다.기존의 µPAD는 종이 기판 위에 구축된 친수성/소수성 구조로 구성됩니다.3차원 구조에 따라 μPAD는 2차원(2D) 및 3차원(3D) μPAD로 나눌 수 있습니다.2D µPAD는 소수성 경계를 형성하여 미세유체 채널을 형성하여 생산되는 반면 3D µPAD는 일반적으로 종이 접기, 슬립 기술, 개방 채널 및 3D 인쇄를 통해 2D 미세 유체 종이의 스택으로 만들어집니다[96].μPAD의 수성 또는 생물학적 유체는 외부 전원 없이 주로 모세관 힘에 의해 제어되어 시약의 사전 저장, 샘플 처리 및 다중 검출을 용이하게 합니다.그러나 불충분한 감지 속도, 감도 및 재사용 가능성으로 인해 정확한 흐름 제어 및 다중 감지가 저해됩니다[96, 127, 128, 129, 130].
특이한 미세유체 플랫폼으로서 μPAD는 HCV, HIV, SARS-CoV-2와 같은 전염병의 분자 진단을 위해 널리 홍보되고 개발되었다[131, 132].HCV의 선택적이고 민감한 검출을 위해 Tengam et al.[133]은 pyrrolidinyl 펩타이드를 기반으로 한 매우 특이적인 핵산 프로브를 사용하여 형광 종이 기반의 새로운 바이오 센서를 개발했습니다.핵산은 아미노 그룹과 알데하이드 그룹 사이의 환원성 알킬화에 의해 부분적으로 산화된 셀룰로오스 종이에 공유적으로 고정되고 검출은 형광을 기반으로 합니다.이 신호는 휴대 전화 카메라와 결합된 휴대용 형광 카메라와 함께 특수 제작된 장치로 읽을 수 있습니다.이어서 Lu et al.[134]는 메틸렌 블루를 DNA 산화환원 지시약으로 사용하는 DNA 혼성화에 의한 HIV 표적 검출을 위해 니켈/금 나노입자/탄소 나노튜브/폴리비닐 알코올 유기금속 프레임워크 합성물을 기반으로 하는 종이 기반의 유연한 전극을 설계했습니다.보다 최근에는 Chowdury et al.[135]는 COVID-19 분석물 검출을 위한 LAMP 및 휴대용 이미징 기술과 함께 원시 환자 타액을 사용하여 현장 진료 μPAD 테스트를 위한 가상 플랫폼 설계를 제시했습니다.
측면 흐름 테스트는 모세관력에 의해 유체를 안내하고 다공성 또는 미세 구조 기판의 습윤성 및 특성에 의해 유체 이동을 제어합니다.측면 흐름 장치는 샘플, 접합체, 배양기 및 검출기, 흡수 패드로 구성됩니다.LFA의 핵산 분자는 결합 부위에 미리 저장된 특정 결합제를 인식하고 복합체로 결합합니다.액체가 인큐베이션 및 검출 플레이트를 통과할 때 복합체는 테스트 및 제어 라인에 있는 포획 분자에 의해 포획되어 육안으로 직접 읽을 수 있는 결과를 보여줍니다.일반적으로 LFA는 기존 검색보다 빠른 2~15분 내에 완료할 수 있습니다.특별한 메커니즘으로 인해 LFA는 작업이 거의 필요하지 않고 추가 장비가 필요하지 않아 매우 사용자 친화적입니다.제조 및 소형화가 용이하며 종이 기재의 비용이 저렴합니다.그러나 정성적 분석에만 사용되며 정량적 검출이 매우 어렵고 다중화 능력과 처리량이 매우 제한적이며 한 번에 하나의 충분한 핵산만 검출할 수 있다[96,110,127].
LFA의 대부분의 응용 프로그램은 면역 분석에 중점을 두고 있지만 미세 유체 칩의 분자 진단에 LFA를 사용하는 것도 효과적이고 대중적입니다[136].B형 간염 바이러스의 경우 HIV 및 SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137]은 상향 변환 나노 입자 LFA 플랫폼을 제안하고 HBV 핵산과 같은 다중 표적의 감도 및 정량적 검출을 통해 이 소형화된 휴대용 플랫폼의 다양성을 입증했습니다.또한 Fu et al.[138]은 낮은 농도에서 HIV-1 DNA의 정량 분석을 위해 표면 강화 라만 분광법에 기반한 새로운 LFA를 시연했습니다.SARS-CoV-2의 신속하고 민감한 탐지를 위해 Liu et al.[85]는 RT-RPA와 범용 측면 흐름 감지 시스템을 단일 미세 유체 시스템으로 결합하여 미세 유체 통합 RPA 측면 흐름 분석을 개발했습니다.
다양한 미세 유체 플랫폼의 응용 프로그램은 플랫폼의 기능과 장점을 최대한 활용하여 특정 연구에 따라 다릅니다.저렴한 밸브, 펌프 및 덕트를 갖춘 LOCC는 응용 프로그램 다양성 및 상호 운용성을 위한 가장 포괄적인 플랫폼으로 개발 여지가 가장 넓습니다.따라서 우리는 LOCC에서 가장 먼저 최신 연구를 수행하고 조건을 최적화하기를 희망하고 권장합니다.또한 시스템에서 보다 효율적이고 정확한 방법을 발견하여 사용할 수 있을 것으로 기대됩니다.LOAD는 기존 LOCC 장치의 유체를 정밀하게 제어하는 ​​데 탁월하며 외부 드라이브 없이 원심력에 의해 단일 드라이브에서 고유한 이점을 보여주며 병렬 응답은 분리 및 동기화할 수 있습니다.따라서 앞으로 LOAD는 수동 조작이 적고 성숙하고 자동화된 기술을 갖춘 주요 미세 유체 플랫폼이 될 것입니다.µPAD 플랫폼은 저렴한 일회용 진단을 위해 LOCC와 종이 기반 재료의 장점을 결합합니다.따라서 향후 개발은 편리하고 잘 정립된 기술에 중점을 두어야 합니다.또한 LFA는 육안 검출에 매우 적합하여 시료 소비를 줄이고 검출 속도를 높일 수 있습니다.자세한 플랫폼 비교는 표 2에 나와 있습니다.
디지털 분석은 샘플을 여러 개의 마이크로리액터로 나눕니다. 각 마이크로리액터에는 개별적인 수의 표적 분자가 포함되어 있습니다[139, 140].디지털 분석은 연속 단계가 아닌 미크론 규모의 구획에서 수천 개의 병렬 생화학 실험을 동시에 개별적으로 수행하여 절대 정량을 수행하는 데 상당한 이점을 제공합니다.기존의 미세유체에 비해 구획 반응은 채널, 펌프, 밸브 및 소형 설계 없이도 시료 부피를 줄이고 반응 효율을 높이며 다른 분석 방법과 쉽게 통합할 수 있습니다[141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .세포, 핵산 및 기타 입자 또는 분자와 같은 시약 및 샘플을 포함하여 용액의 균일하고 정확한 분리를 달성하기 위해 디지털 분석에서 다음 두 가지 방법이 사용됩니다. (1) 액체 계면 불안정성을 이용하는 드롭 에멀젼;(2) 어레이 분할은 장치의 기하학적 제약에 의해 수행됩니다.첫 번째 방법에서 미세 채널의 시약 및 샘플을 포함하는 액적은 병류, 교차 흐름, 흐름 집중, 단계적 유화, 미세 채널 유화 및 채널 변경에 따른 점성 전단력 및 유화를 통한 멤브레인과 같은 수동 방법으로 생성할 수 있습니다.국소화[143, 145, 146, 148, 149] 또는 전기, 자기, 열 및 기계적 제어를 통해 추가 에너지를 도입하는 능동 방법[150, 151]을 사용합니다.후자의 접근법에서, 미세유체 챔버에서 최고의 유체 부피 균일성은 마이크로피트 및 표면 어레이와 같은 동일한 크기의 공간 구조를 유지함으로써 공유됩니다[152,153,154].특히, 액적은 디지털 미세유체(DMF)를 기반으로 하는 전극 어레이에서 생성 및 조작될 수도 있는 주요 흐름 섹션입니다.유전체의 전기습윤은 가장 잘 연구된 DMF 이론 중 하나입니다. 유전체의 전기습윤은 개별 방울의 정밀한 조작을 가능하게 하여 액체의 모양과 다른 면을 통과하는 비대칭 전기 신호를 제어할 수 있기 때문입니다[141, 144].DMF에서 액적을 사용하는 주요 작업은 분류, 분할 및 병합[151, 155, 156]이며, 이는 다양한 분석 분야, 특히 분자 검출[157, 158, 159]에 적용될 수 있습니다.
디지털 핵산 검출은 고처리량 시퀀싱 및 액체 생검과 병행하여 기존의 PCR 및 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 이은 3세대 분자 진단 기술입니다.지난 20년 동안 디지털 핵산은 감염성 병원체의 분자 진단 분야에서 빠르게 발전했습니다[160, 161, 162].디지털 핵산 검출의 절대 정량화는 샘플과 시약을 개별 구획에 포장하여 각 표적 서열이 각 구획에 들어갈 동일한 확률을 갖도록 하는 것으로 시작됩니다.이론적으로 각 섹션에는 다중 표적 서열이 할당되거나 독립적인 미세 반응 시스템이 없을 수 있습니다.위에서 설명한 다양한 감지 메커니즘을 통해 특정 임계값 이상의 신호를 생성하는 미생물 표적 서열이 있는 구획은 육안으로 또는 기계로 시각화할 수 있고 양성으로 표시되는 반면 임계값 미만의 신호를 생성하는 다른 구획은 양성으로 표시됩니다. .음수, 각 섹션에 대한 신호를 부울로 만듭니다.따라서 생성된 구획의 수와 반응 후 양성 결과의 비율을 계산하여 일상적인 정량 분석에 필요한 표준 곡선 없이도 Poisson 분포 공식을 사용하여 테스트 샘플의 원본 복사본을 일치시킬 수 있습니다. qPCR로.기존의 분자 진단 방법에 비해 디지털 핵산 검출은 자동화 수준이 높고 분석 속도와 감도가 높으며 시약이 적고 오염이 적으며 설계 및 제조가 간단합니다.이러한 이유로, 증폭 및 신호 판독 기술을 결합한 분자 진단을 위한 디지털 분석, 특히 드롭 기반 방법의 사용은 SARS-CoV-2의 심각한 발병 기간 동안 잘 연구되었습니다.예를 들어, Yin et al.미세 유체 칩에서 SARS-CoV-2의 ORF1ab, N 및 RNase P 유전자를 검출하기 위해 액적 디지털 및 고속 PCR 방법을 결합했습니다.특히, 이 시스템은 기존 PCR보다 빠른 115초 이내에 양성 신호를 식별할 수 있어 현장 진단에서 그 효과를 나타냅니다(그림 7a).Donget al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] 및 Alteri et al.[167] 또한 ddPCR(droplet digital PCR)을 적용하여 인상적인 결과를 가진 미세 유체 시스템에서 SARS-CoV-2를 감지했습니다.검출률을 더욱 향상시키기 위해 Shen et al.[168]은 이미지 스티칭 기술을 사용하지 않고 15초 만에 ddPCR 기반 칩 이미징을 달성하여 연구실에서 응용 프로그램으로 ddPCR 기술 프로세스의 속도를 높였습니다.PCR과 같은 열증폭법을 적용할 뿐만 아니라 등온증폭법을 적용하여 반응조건을 단순화하고 반응을 빠르게 합니다.Luet al.[71]은 한 단계에서 고밀도로 다양한 크기의 액적을 생성하고 디지털 LAMP를 사용하여 SARS-CoV-2 핵산을 정량할 수 있는 액적 분석을 위한 SlipChip을 개발했습니다(그림 7b).빠르게 발전하는 기술인 CRISPR는 추가 핵산 염색 없이 편리한 비색 이미징을 통해 디지털 핵산 검출에서도 중요한 역할을 할 수 있습니다.Ackerman et al.핵산의 다중 평가를 위한 조합 매트릭스 반응을 개발했습니다.[158]은 마이크로웰 분석에서 CRISPR-Cas13 기반 핵산 검출 시약을 포함하는 액적에서 SARS-CoV-2를 포함한 169개의 인간 관련 바이러스를 검출했습니다(그림 7c).또한 등온 증폭 및 CRISPR 기술을 동일한 시스템에서 사용하여 두 가지 이점을 결합할 수 있습니다.Parket al.[169] CRISPR/Cas12a 디지털 분석은 더 짧고 더 높은 신호 대 배경 검출을 가진 단일 단계 RT-RPA를 기반으로 하여 추출 및 가열 사멸된 SARS-CoV-2의 검출을 위한 상용 미세유체 칩에서 개발되었습니다. 시간 비율., 더 넓은 동적 범위 및 더 나은 감도(그림 7d).이러한 예에 대한 일부 설명이 표 3에 나와 있습니다.
핵산 검출을 위한 일반적인 디지털 플랫폼입니다.a 신속한 디지털 PCR 워크플로는 샘플 준비, 반응 혼합물의 분배, 증폭 과정 및 표적 정량의 4가지 주요 단계로 구성됩니다([164]에서 수정).b 고밀도에서 액적 형성에 대한 슬립칩 액적 분석을 보여주는 개략도([71]에서 수정).c CARMEN-Cas 워크플로 다이어그램13([158]에서 수정).d 하나의 포트에서 CRISPR/Cas를 사용한 고급 디지털 바이러스 탐지 개요([169]에서 수정).W/O 유중수, 폴리디메틸실록산 PDMS, PCR 중합효소 연쇄 반응, DAQ 데이터 수집, PID 비례 적분 유도체, 다중 핵산 평가를 위한 CARMEN 조합 매트릭스 반응, SARS-CoV-2, 중증 급성 호흡기 증후군, 코로나바이러스 2, RT 역전사효소 재조합효소 중합효소-RPA, 백그라운드에서 S/B 신호 증폭